Клеточно-специфическая экспрессия рецептора к следовым аминам 1 (TAAR1) в нейронах различных отделов головного мозга: транскриптомный анализ с использованием общедоступных баз данных

Актуальность

Рецептор 1, ассоциированный со следовыми аминами (TAAR1), относится к семейству рецепторов, сопряжённых с G-белком (GPCR). Он проявляет универсальные сигнальные свойства, связываясь с несколькими подтипами G-белков, включая Gs, Gq и G13, тем самым опосредуя разнообразные внутриклеточные сигнальные каскады [1].

TAAR1 организует передачу сигнала через широкий спектр агонистов, включая эндогенные следовые амины, моноаминовые нейротрансмиттеры, а также экзогенные психостимулирующие препараты класса амфетаминов [2]. Следовые амины обнаруживаются в мозге млекопитающих в концентрациях примерно в 1000 раз ниже, чем катехоламины. Было высказано предположение, что следовые амины функционируют как нейромодуляторы в классических нейромедиаторных системах. TAAR1 недавно стал перспективной терапевтической мишенью для лечения нейропсихиатрических расстройств [3]. В частности, агонисты TAAR1 представляют интерес в качестве потенциальных препаратов для лечения шизофрении из-за их выраженного антипсихотического эффекта в моделях на грызунах и регуляции дофаминергического тонуса [4]. Агонисты TAAR1 также проявляют антидепрессантную/снижающую стресс активность; прокогнитивные, евгероические, антиноцицептивные, антинарколептические и антикаталептические эффекты [5, 6].

Агонистом TAAR1 являются также 3-йодтиронамин (3-T1AM) и тиронамин (T0AM), эндогенные производные тиреоидных гормонов, которые показали способность проникать через гематоэнцефалический барьер [7] и оказывать нейропротекторные эффекты [8-10]. В частности, было показано, что, действуя через TAAR1, тиронамины ингибируют воспалительный ответ в астроцитах, модулируя высвобождение провоспалительных (ФНО-α, ИЛ-6) и противовоспалительных (ИЛ-10) интерлейкинов [11]. Введение T1AM способно устранить нейрональную дисфункцию, вызванную β-амилоидом, у мышей дикого типа [12]. В исследованиях in vivo введение 3-T1AM стимулирует обучение, полностью обращает амнезию, вызванную скополамином, снижает ноцицептивный порог, вызывая гипералгезию [13-15].

Несмотря на растущий интерес к физиологической роли тиронаминов, их точные механизмы действия, профиль токсичности и влияние на специфические популяции клеток центральной нервной системы остаются недостаточно изученными. Одним из факторов, ограничивающих прогресс в данной области, является отсутствие детальных данных о точной анатомической и клеточной локализации TAAR1 в мозге млекопитающих, и в особенности человека [16]. Хотя экспрессия TAAR1 на уровне мРНК была описана для ряда мозговых структур, информация о распределении рецептора в конкретных типах нейронов и глиальных клеток остаётся фрагментарной.

Цель

Определить паттерн экспрессии TAAR1 в клетках и тканях головного мозга с помощью анализа общедоступных баз данных экспрессии генов.

Полученные в данной работе данные о морфологических структурах мозга с максимальной плотностью TAAR1 будут использованы для получения первичных клеточных культур, обогащённых клетками-мишенями для тиронаминов, что послужит основой для следующего критического этапа исследований: изучения цитотоксичности и механизмов действия тиронаминов. Кроме того, поскольку TAAR1 представляются перспективной фармакологической мишенью для нейропротекции и терапии различных неврологических и нейропсихических расстройств, информация о распределении экспрессии TAAR1 может быть полезна для формирования научной базы для включения данной мишени в приоритетные направления разработки инновационных лекарственных средств в рамках отечественной фармацевтической отрасли.

Материалы и методы

Для анализа экспрессии TAAR1 использовались общедоступные транскриптомные наборы данных головного мозга, обеспечивающие полный охват нормальных состояний тканей и клеток мозга человека и грызунов.

Поиск релевантных баз данных осуществлялся на платформах Brain Knowledge Platform и FAIRsharing.org (по запросу brain gene expression).

Критерии включения:

• база данных обеспечивает открытый доступ и предоставляет четкую документацию;
• имеется пространственная привязка к анатомическим регионам мозга и/или клеточная типизация;
• данные относятся к экспрессии в мозге человека или модельных организмов, релевантных для исследования нейробиологических функций;
• данные содержат обработанные или нормализованные матрицы экспрессии.

Критерии исключения:

• база данных посвящена отдельным патологиям (например, болезнь Альцгеймера, шизофрения, нейродегенеративные заболевания);
• база данных охватывает только одну структуру мозга;
• TAAR1 присутствует в итоговой матрице экспрессии, но уровень экспрессии равен нулю вследствие отсутствия детекции, технических ограничений платформы или особенностей подготовки библиотек.

Схема отбора данных, включённых в исследование, показана на рис. 1.

Рис. Блок-схема отбора наборов данных

В исследование были включены следующие наборы данных:

1. Атлас мозга человека (Human Brain Atlas Microarray) Института Аллена [17].

Содержит данные микрочипов из 3702 образцов, взятых из различных областей шести нейротипичных мозгов взрослых людей. Образцы распределены по кортикальным, подкорковым структурам, стволу мозга и мозжечковым областям в каждом мозге и количественно оценивают уровни экспрессии более 20000 генов. Количественная оценка экспрессии основана на гибридизации зондов, аннотированных в соответствии с соответствующими версиями геномной сборки человека (hg18/GRCh36) на момент создания платформы. Данные обрабатывались с помощью пакета abagen языка Python версии 3.14 (https://github.com/rmarkello/abagen), в котором используются этапы предварительной обработки, рекомендованные Arnatkevičiūte et al., 2019 [18].

2. Allen Brain Cell Atlas, набор данных «Neurons. Human braincell type diversity» («Разнообразие типов клеток мозга человека: нейроны») [19].

Включает данные об экспрессии генов в мозге человека, полученные с помощью технологии snRNA-seq, выровненные к стандартной референсной сборке человека GRCh38 и организованные с использованием статистического метода t-SNE. В наборе данных все клетки классифицируются по 31 суперкластеру — самой широкой категории, которая далее иерархически разветвляется до 461 кластера и 3313 подкластеров. Каждый суперкластер содержит клетки со схожими общими транскрипционными или функциональными характеристиками и назван на основе группировки схожих клеток. Клетки разделяются по 13 анатомическим отделам. Анализ данных производился с помощью интерфейса, представленного на сайте https://knowledge.brain-map.org. Название гена вводилось во вкладке Genes, а анатомические структуры и типы клеток задавались через фильтры Neurotransmitter Type и Anatomical Division. Все клетки и образцы, в которых целевой ген имел ненулевое нормализованное значение экспрессии, включались в анализ.

3. Атлас развивающегося мозга человека BrainSpan (Allen Institute for Brain Science. Allen Developing Human Brain Atlas: Developmental Transcriptome) [20].

Данные РНК-секвенирования (RNA-seq) были получены из тканей 42 посмертных мозгов физиологически здоровых людей разного возраста, начиная с раннего внутриутробного развития (8 недель после зачатия) и до позднего возраста (40 лет). Мозг был разделён на 19 неперекрывающихся анатомических областей. Данные РНК-секвенирования были аннотированы с использованием информации о генах и экзонах из GENCODE версии 10 (GRCh37–Ensembl 65). Уровни экспрессии экзонов количественно определялись в единицах RPKM (число прочтений на килобазу на миллион картированных прочтений). Для анализа использовали набор «RNA-Seq Gencode v10 summarized to genes». Данные об экспрессии TAAR1 извлекались с использованием языка R версии 4.5.2.

4. Атлас транскриптомных типов клеток всего мозга мыши (Whole Mouse Brain Transcriptomic Cell Type Atlas).

Это транскриптомная таксономия типов клеток всего мозга мыши, объединяющая несколько наборов данных секвенирования РНК отдельных клеток всего мозга (scRNA-seq). В качестве референсного транскриптома использовали транскриптом мыши (M21, GRCm38.p6). Наборы данных содержат в общей сложности около 4 миллионов клеток. Все клетки классифицируются на 5322 кластера, организованных иерархически по классам, подклассам, супертипам и типам [21]. Анализ данных производился с помощью интерфейса, представленного на сайте https://knowledge.brain-map.org. Все клетки и образцы, в которых TAAR1 имел ненулевое нормализованное значение экспрессии, включались в анализ.

Результаты

1. Атлас мозга человека Института Аллена

Перед анализом данных из Атласа мозга человека Института Аллена мы провели их нормализацию и усреднение между донорами с использованием инструмента abagen. Первые шаги этого процесса заключаются в следующем [22]:

• зонды с микрочипами были повторно аннотированы, и те, которые не соответствовали действительным идентификаторам Entrez ID, были устранены;
• зонды с уровнем ниже фонового шума и одновременно ≥50% образцов среди доноров были удалены с помощью фильтрации на основе интенсивности.

Уже на этих этапах все образцы, показывающие уровень экспрессии TAAR1, были исключены из дальнейшего исследования. Таким образом, применяемый в Атласе мозга человека метод микрочипов недостаточно чувствителен для оценки уровня экспрессии TAAR1. Поэтому для дальнейшей работы были выбраны наборы данных, полученные с использованием методов секвенирования нового поколения, в том числе позволяющих проводить секвенирование на уровне единичных клеток.

2. Allen Brain Cell Atlas

В наборе данных «Нейроны» Allen Brain Cell Atlas было найдено всего 47 клеток, экспрессирующих TAAR1. Уровень экспрессии варьировался от 3,9 до 7,3 log₂(CPM + 1). 33 из найденных нейронов относятся к суперкластеру Amygdala excitatory. Это возбуждающие глутаматэргические нейроны. Всего же из нейронов, экспрессирующих TAAR1, 40 оказались глутаматэргическими, 7 – ГАМК-эргическими.

Распределение нейронов по структурам мозга показано в таблице 1.

3. Атлас развивающегося мозга человека BrainSpan

В данных Атласа развивающегося мозга человека экспрессия TAAR1 была обнаружена только в отдельных образцах (таблица 2). Экспрессия не обнаружена ни у одного донора, находящегося в эмбриональном периоде развития. Минимальный возраст донора, у которого была обнаружена экспрессия TAAR1 в мозге, составил 4 месяца.

3. Атлас транскриптомных типов клеток всего мозга мыши

В наборе данных «Whole Mouse Brain Transcriptomic Cell Type Atlas» была найдена 91 клетка, экспрессирующая TAAR1 (таблица 3). Уровень экспрессии варьировался от 3,1 до 7,1 log₂(CPM + 1). 47 нейронов принадлежали к кластеру 24 MY Glut. 58 нейронов по типу синапсов относились к глутаматэргическим, 20 — к ГАМК-эргическим.

Обсуждение

Впервые семейство рецепторов, ассоциированных со следовыми аминами, было идентифицировано в работе Borowsky В. et al. [23] в 2001 году. Авторами была также предпринята попытка описать локализацию TAAR рецепторов. Митохондриальная РНК человеческого гена TAAR1 была обнаружена методом количественной обратной транскрипции ОТ-ПЦР в низких концентрациях в отдельных регионах центральной нервной системы: в миндалевидном теле, мозжечке, ганглиях задних корешков, гиппокампе, гипоталамусе, продолговатом мозге, гипофизе, ретикулярной формации моста [23].

Широкое распределение мРНК TAAR1 было выявлено в ЦНС мышей с помощью гибридизации in situ, а сигнал гибридизации был локализован в цитоплазме нейрональных профилей. Несколько областей мозга показали интенсивную маркировку: митральный слой клеток обонятельной луковицы, грушевидная кора, дугообразные, двигательные и мезэнцефальные ядра тройничного нерва, латеральные ретикулярные и подъязычные ядра, клетки Пуркинье мозжечка и вентральные рога спинного мозга. Умеренная маркировка была обнаружена во фронтальной, энторинальной и агранулярной коре, вентральном бледном шаре, таламусе, гиппокампе, нескольких ядрах гипоталамуса, амбивалентном ядре, дорсальном ядре шва и гигантоклеточных ретикулярных ядрах. Более слабое окрашивание наблюдалось в перегородке, базальных ганглиях, миндалевидном теле, продолговатом мозге и задних рогах спинного мозга. Особый интерес представляла умеренная экспрессия мРНК TAAR1 в нескольких группах моноаминергических клеток, а именно в дорсальной зоне шва, голубом пятне и вентральной области покрышки [23].

В работе Bunzow J.R. et al. метод «Нозерн-блотт» тотальной РНК, полученной из различных областей мозга, а также гибридизация in situ срезов мозга крысы не выявили наличия TAAR1. Однако при использовании более чувствительного метода ОТ-ПЦР сигналы были обнаружены от РНК, полученной из различных областей мозга. С помощью этого полуколичественного метода было установлено, что сигнал, по-видимому, широко распространён по всему мозгу, с наивысшими уровнями экспрессии, обнаруженными в обонятельной луковице, обонятельном бугорке, префронтальной коре и других областях коры, в чёрной субстанции и вентральной покрышке среднего мозга, в некоторых областях мозжечка, моста и продолговатого мозга [24].

Для изучения физиологической роли TAAR1 in vivo Lindemann L. et al. был получен мутант мыши, в котором вся кодирующая последовательность TAAR1 была заменена репортерным геном, состоящим из гена LacZ, который кодирует бактериальную β-галактозидазу, и гена сигнала ядерной локализации (NLS). В целевом аллеле LacZ экспрессируется с использованием эндогенного промотора TAAR1, что обеспечивает чувствительный метод для изучения распределения TAAR1 в тканях [16]. Эксперименты с ОТ-ПЦР выявили низкий уровень экспрессии TAAR1 в мозге мышей. Окрашивание серийных срезов мозга взрослых особей с нокаутом TAAR1 и особей дикого типа выявило дискретное и специфичное расположение ядер, экспрессирующих TAAR1, преимущественно в дофаминергических и серотонинергических областях мозга; в частности, в гипоталамусе и преоптической области, вентральной области покрышки, миндалевидном теле, дорсальном ядре шва, ядре одиночного пути, в парагиппокампальной области (ринальной коре) и субикулюме. TAAR1 не обнаружили в обонятельной луковице и клетках Пуркинье [16].

В исследовании Revel F. et al., радиоактивная гибридизация in situ не позволила обнаружить уровни мРНК TAAR1 в мозге у мышей дикого типа. Чтобы более подробно изучить физиологическую роль TAAR1, авторами была создана генетически модифицированная линия мышей, в которой TAAR1 сверхэкспрессируется в нейронах. Однако данная модель не позволяет оценить распространение экспрессии TAAR1, так как у генетически модифицированных мышей она повышена, в том числе и в тех структурах, которые обычно не экспрессируют этот рецептор [25].

Таким образом, большинство исследований показывает, что по крайней мере в мозге TAAR1 экспрессируется на низком уровне. Однако эти данные противоречат более раннему сообщению Borowsky B., полученному с использованием нерадиоактивной гибридизации in situ. Такие расхождения могут быть результатом видовых и/или методологических различий и иллюстрируют сложности надёжного обнаружения экспрессии Taar1 [25].

Для изучения роли TAAR в процессе развития и созревания дофаминергических нейронов, экспрессия TAAR была проанализирована с помощью ПЦР TaqMan Realtime в различные временные точки дифференцировки трёх линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека (AD3, WTSIi004-A, WTSIi032-A) в дофаминовые нейроны. Авторы обнаружили лишь спорадическую экспрессию TAAR5 в анализируемых линиях клеток на всех этапах процесса дифференцировки и не обнаружили экспрессии каких-либо других типов TAAR [26]. Анализ когорты ИПСК человека HipSci, которые дифференцировали в нейроны среднего мозга, показал, что экспрессия TAAR1 может быть обнаружена на поздних стадиях дифференцировки (к 52-му дню) [26, 27].

В связи с успехами в разработке лекарственных препаратов, направленных на TAAR1, в последние годы предпринимались попытки визуализации рецептора в мозге in vivo с помощью методов позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Так, разработанный на основе антагониста TAAR1 лиганд [11C]TAAR1-1911 показывал высокую аффинность связывания с рецептором in vitro, но не мог использоваться in vivo из-за высокой скорости метаболической деградации [28]. Разработанный лиганд [18F]TAAR1-2203 продемонстрировал высокую метаболическую стабильность in vivo и позволил оценить занятость рецепторов in vivo с помощью ПЭТ в почках и поджелудочной железе. Интенсивность сигнала была заметно снижена у животных с нокаутом TAAR1. Однако специфического связывания с TAAR1 в ЦНС не наблюдалось, хотя [18F]TAAR1-2203, по-видимому, проникал через гематоэнцефалический барьер [2]. Эти результаты подчёркивают сложности визуализации TAAR1 в ЦНС в фоновых условиях.

Результаты проведённого нами анализа общедоступных баз данных экспрессии генов в клетках и тканях головного мозга подтверждают сообщения о низком уровне базовой экспрессии TAAR1 в клетках мозга. В связи с этим метод микрочипов не даёт возможности оценить экспрессию TAAR1 из-за того, что её уровень ниже уровня шума. Более перспективными для исследований являются методы секвенирования нового поколения, в особенности — одноклеточное и одноядерное секвенирование.

Сравнение данных «Allen Brain Cell Atlas» и «BrainSpan» показывает частичное пересечение структур, в которых была обнаружена экспрессия TAAR1. Это различные области коры больших полушарий, миндалевидный комплекс, гиппокамп, таламус. В то же время в мозге мыши, согласно данным «Whole Mouse Brain Transcriptomic Cell Type Atlas» паттерн экспрессии значительно отличался: наблюдалась экспрессия в клетках продолговатого мозга, среднего мозга, гипоталамуса. Ни в одном наборе не была обнаружена экспрессия TAAR1 в клетках мозжечка.

Экспрессия TAAR1 не была обнаружена на всех стадиях эмбрионального развития.

Обращает на себя внимание, что при проведении транскриптомной классификации и у человека, и у мыши большинство клеток, экспрессирующих TAAR1, принадлежат к одному кластеру. В обоих случаях это глутаматергические нейроны. Большинство нейронов, у которых найдена экспрессия TAAR1, по типу синапсов относились к глутаматэргическим, на втором месте были ГАМК-ергические нейроны. Недавние исследования показывают, что TAAR1 регулирует глутаматергическую передачу зависимым от состояния образом — снижая спонтанную нейронную активность и усиливая электрически вызванное высвобождение глутамата [3]. Хотя считается, что TAAR1 играет ключевую регуляторную роль в модуляции моноаминергической передачи, особенно в префронтальной коре головного мозга, и есть сообщения о том, что его мРНК локализуется в моноаминергических ядрах [29], в наборе Allen Brain Cell Atlas таких нейронов не оказалось.

Ограничения

Существенная вариабельность между источниками данных (различия в видах организмов, технологиях секвенирования, протоколах подготовки библиотек) не позволила нам провести статистический анализ или метаанализ. В связи с этим мы сосредоточились на систематическом обзоре публично доступных экспрессионных данных. Учитывая эти ограничения, для получения количественных оценок экспрессии использовались встроенные методы нормализации и подсчёта, доступные непосредственно в интерфейсах соответствующих баз данных. Качество картирования, показатели чтений, а также критерии фильтрации (минимальное число прочтений, метрики качества) не пересчитывались.

Потенциально значимый интерес представляют данные о протеомной экспрессии TAAR1 в тканях головного мозга; однако в ходе поиска не было выявлено баз данных, удовлетворяющих установленным критериям включения и исключения.

Заключение

В целом TAAR1, по-видимому, гетерогенно распределён в центральной нервной системе, и характеризуется низким уровнем базальной экспрессии. В связи с этим для дальнейших исследований его экспрессии актуально использование новейших технологий одноядерного и одноклеточного секвенирования, а также разработка методов визуализации рецепторов in vivo. Анализ общедоступных баз данных экспрессии генов в клетках и тканях головного мозга выявил наличие клеток, экспрессирующих TAAR1 в таких структурах мозга человека, как кора больших полушарий, миндалевидный комплекс, базальные ядра, гиппокамп, таламус. Значительные расхождения в обнаруженных паттернах экспрессии в транскриптомных наборах человека и мыши указывают на возможность видовых различий в экспрессии TAAR1.

Заявление о доступности данных

Материалы и данные Институт науки о мозге Аллена могут свободно использоваться для исследовательских целей с условием должного цитирования:

• Allen Institute for Brain Science (2010). Allen Human Brain Atlas: Microarray [Dataset]. Available from brain-map.org. RRID:SCR_007416
• Sten Linnarsson, Ed Lein, Trygve Bakken (2023) Transcriptomic Characterization of Cell Types in Human Brain. [Dataset]. Available from https://assets.nemoarchive.org/dat-5ie1mec
• Allen Institute for Brain Science (2010). Allen Developing Human Brain Atlas: Developmental Transcriptome [Dataset]. Available from brainspan.org. RRID:SCR_008083
• Hongkui Zeng, Zizhen Yao, Cindy van Velthoven, Kimberly A. Smith, Bosiljka Tasic, Changkyu Lee, Jeff Goldy, Anish Bhaswanth Chakka, Thuc Nghi Nguyen, Michael Tieu, Nick Dee,Junitta Guzman, Trangthanh Pham, Amy Torkelson, Rushil Chakrabarty, Tim Dolbeare, Nathan Guilford (2023). Whole Mouse Brain Transcriptomic Cell Type Atlas - 10x scRNAseq whole brain. [Dataset] Available from https://assets.nemoarchive.org/dat-qg7n1b0