Рецептор 1, ассоциированный со следовыми аминами (TAAR1), относится к семейству рецепторов, сопряжённых с G-белком (GPCR). Он проявляет универсальные сигнальные свойства, связываясь с несколькими подтипами G-белков, включая Gs, Gq и G13, тем самым опосредуя разнообразные внутриклеточные сигнальные каскады [1].

TAAR1 организует передачу сигнала через широкий спектр агонистов, включая эндогенные следовые амины, моноаминовые нейротрансмиттеры, а также экзогенные психостимулирующие препараты класса амфетаминов [2]. Следовые амины обнаруживаются в мозге млекопитающих в концентрациях примерно в 1000 раз ниже, чем катехоламины. Было высказано предположение, что следовые амины функционируют как нейромодуляторы в классических нейромедиаторных системах. TAAR1 недавно стал перспективной терапевтической мишенью для лечения нейропсихиатрических расстройств [3]. В частности, агонисты TAAR1 представляют интерес в качестве потенциальных препаратов для лечения шизофрении из-за их выраженного антипсихотического эффекта в моделях на грызунах и регуляции дофаминергического тонуса [4]. Агонисты TAAR1 также проявляют антидепрессантную/снижающую стресс активность; прокогнитивные, евгероические, антиноцицептивные, антинарколептические и антикаталептические эффекты [5, 6].

Агонистом TAAR1 являются также 3-йодтиронамин (3-T1AM) и тиронамин (T0AM), эндогенные производные тиреоидных гормонов, которые показали способность проникать через гематоэнцефалический барьер [7] и оказывать нейропротекторные эффекты [8-10]. В частности, было показано, что, действуя через TAAR1, тиронамины ингибируют воспалительный ответ в астроцитах, модулируя высвобождение провоспалительных (ФНО-α, ИЛ-6) и противовоспалительных (ИЛ-10) интерлейкинов [11]. Введение T1AM способно устранить нейрональную дисфункцию, вызванную β-амилоидом, у мышей дикого типа [12]. В исследованиях in vivo введение 3-T1AM стимулирует обучение, полностью обращает амнезию, вызванную скополамином, снижает ноцицептивный порог, вызывая гипералгезию [13-15].

Несмотря на растущий интерес к физиологической роли тиронаминов, их точные механизмы действия, профиль токсичности и влияние на специфические популяции клеток центральной нервной системы остаются недостаточно изученными. Одним из факторов, ограничивающих прогресс в данной области, является отсутствие детальных данных о точной анатомической и клеточной локализации TAAR1 в мозге млекопитающих, и в особенности человека [16]. Хотя экспрессия TAAR1 на уровне мРНК была описана для ряда мозговых структур, информация о распределении рецептора в конкретных типах нейронов и глиальных клеток остаётся фрагментарной.

Определить паттерн экспрессии TAAR1 в клетках и тканях головного мозга с помощью анализа общедоступных баз данных экспрессии генов.

Полученные в данной работе данные о морфологических структурах мозга с максимальной плотностью TAAR1 будут использованы для получения первичных клеточных культур, обогащённых клетками-мишенями для тиронаминов, что послужит основой для следующего критического этапа исследований: изучения цитотоксичности и механизмов действия тиронаминов. Кроме того, поскольку TAAR1 представляются перспективной фармакологической мишенью для нейропротекции и терапии различных неврологических и нейропсихических расстройств, информация о распределении экспрессии TAAR1 может быть полезна для формирования научной базы для включения данной мишени в приоритетные направления разработки инновационных лекарственных средств в рамках отечественной фармацевтической отрасли.

Для анализа экспрессии TAAR1 использовались общедоступные транскриптомные наборы данных головного мозга, обеспечивающие полный охват нормальных состояний тканей и клеток мозга человека и грызунов.

Поиск релевантных баз данных осуществлялся на платформах Brain Knowledge Platform и FAIRsharing.org (по запросу brain gene expression).

Критерии включения:

Критерии исключения:

Схема отбора данных, включённых в исследование, показана на рис. 1.

Рис. Блок-схема отбора наборов данных

В исследование были включены следующие наборы данных:

Содержит данные микрочипов из 3702 образцов, взятых из различных областей шести нейротипичных мозгов взрослых людей. Образцы распределены по кортикальным, подкорковым структурам, стволу мозга и мозжечковым областям в каждом мозге и количественно оценивают уровни экспрессии более 20000 генов. Количественная оценка экспрессии основана на гибридизации зондов, аннотированных в соответствии с соответствующими версиями геномной сборки человека (hg18/GRCh36) на момент создания платформы. Данные обрабатывались с помощью пакета abagen языка Python версии 3.14 (https://github.com/rmarkello/abagen), в котором используются этапы предварительной обработки, рекомендованные Arnatkevičiūte et al., 2019 [18].

Включает данные об экспрессии генов в мозге человека, полученные с помощью технологии snRNA-seq, выровненные к стандартной референсной сборке человека GRCh38 и организованные с использованием статистического метода t-SNE. В наборе данных все клетки классифицируются по 31 суперкластеру — самой широкой категории, которая далее иерархически разветвляется до 461 кластера и 3313 подкластеров. Каждый суперкластер содержит клетки со схожими общими транскрипционными или функциональными характеристиками и назван на основе группировки схожих клеток. Клетки разделяются по 13 анатомическим отделам. Анализ данных производился с помощью интерфейса, представленного на сайте https://knowledge.brain-map.org. Название гена вводилось во вкладке Genes, а анатомические структуры и типы клеток задавались через фильтры Neurotransmitter Type и Anatomical Division. Все клетки и образцы, в которых целевой ген имел ненулевое нормализованное значение экспрессии, включались в анализ.

Данные РНК-секвенирования (RNA-seq) были получены из тканей 42 посмертных мозгов физиологически здоровых людей разного возраста, начиная с раннего внутриутробного развития (8 недель после зачатия) и до позднего возраста (40 лет). Мозг был разделён на 19 неперекрывающихся анатомических областей. Данные РНК-секвенирования были аннотированы с использованием информации о генах и экзонах из GENCODE версии 10 (GRCh37–Ensembl 65). Уровни экспрессии экзонов количественно определялись в единицах RPKM (число прочтений на килобазу на миллион картированных прочтений). Для анализа использовали набор «RNA-Seq Gencode v10 summarized to genes». Данные об экспрессии TAAR1 извлекались с использованием языка R версии 4.5.2.

Это транскриптомная таксономия типов клеток всего мозга мыши, объединяющая несколько наборов данных секвенирования РНК отдельных клеток всего мозга (scRNA-seq). В качестве референсного транскриптома использовали транскриптом мыши (M21, GRCm38.p6). Наборы данных содержат в общей сложности около 4 миллионов клеток. Все клетки классифицируются на 5322 кластера, организованных иерархически по классам, подклассам, супертипам и типам [21]. Анализ данных производился с помощью интерфейса, представленного на сайте https://knowledge.brain-map.org. Все клетки и образцы, в которых TAAR1 имел ненулевое нормализованное значение экспрессии, включались в анализ.

Перед анализом данных из Атласа мозга человека Института Аллена мы провели их нормализацию и усреднение между донорами с использованием инструмента abagen. Первые шаги этого процесса заключаются в следующем [22]:

Уже на этих этапах все образцы, показывающие уровень экспрессии TAAR1, были исключены из дальнейшего исследования. Таким образом, применяемый в Атласе мозга человека метод микрочипов недостаточно чувствителен для оценки уровня экспрессии TAAR1. Поэтому для дальнейшей работы были выбраны наборы данных, полученные с использованием методов секвенирования нового поколения, в том числе позволяющих проводить секвенирование на уровне единичных клеток.

В наборе данных «Нейроны» Allen Brain Cell Atlas было найдено всего 47 клеток, экспрессирующих TAAR1. Уровень экспрессии варьировался от 3,9 до 7,3 log2(CPM + 1). 33 из найденных нейронов относятся к суперкластеру Amygdala excitatory. Это возбуждающие глутаматэргические нейроны. Всего же из нейронов, экспрессирующих TAAR1, 40 оказались глутаматэргическими, 7 – ГАМК-эргическими.

Распределение нейронов по структурам мозга показано в таблице 1.

В данных Атласа развивающегося мозга человека экспрессия TAAR1 была обнаружена только в отдельных образцах (таблица 2). Экспрессия не обнаружена ни у одного донора, находящегося в эмбриональном периоде развития. Минимальный возраст донора, у которого была обнаружена экспрессия TAAR1 в мозге, составил 4 месяца.

В наборе данных «Whole Mouse Brain Transcriptomic Cell Type Atlas» была найдена 91 клетка, экспрессирующая TAAR1 (таблица 3). Уровень экспрессии варьировался от 3,1 до 7,1 log2(CPM + 1). 47 нейронов принадлежали к кластеру 24 MY Glut. 58 нейронов по типу синапсов относились к глутаматэргическим, 20 — к ГАМК-эргическим.

Впервые семейство рецепторов, ассоциированных со следовыми аминами, было идентифицировано в работе Borowsky В. et al. [23] в 2001 году. Авторами была также предпринята попытка описать локализацию TAAR рецепторов. Митохондриальная РНК человеческого гена TAAR1 была обнаружена методом количественной обратной транскрипции ОТ-ПЦР в низких концентрациях в отдельных регионах центральной нервной системы: в миндалевидном теле, мозжечке, ганглиях задних корешков, гиппокампе, гипоталамусе, продолговатом мозге, гипофизе, ретикулярной формации моста [23].

Широкое распределение мРНК TAAR1 было выявлено в ЦНС мышей с помощью гибридизации in situ, а сигнал гибридизации был локализован в цитоплазме нейрональных профилей. Несколько областей мозга показали интенсивную маркировку: митральный слой клеток обонятельной луковицы, грушевидная кора, дугообразные, двигательные и мезэнцефальные ядра тройничного нерва, латеральные ретикулярные и подъязычные ядра, клетки Пуркинье мозжечка и вентральные рога спинного мозга. Умеренная маркировка была обнаружена во фронтальной, энторинальной и агранулярной коре, вентральном бледном шаре, таламусе, гиппокампе, нескольких ядрах гипоталамуса, амбивалентном ядре, дорсальном ядре шва и гигантоклеточных ретикулярных ядрах. Более слабое окрашивание наблюдалось в перегородке, базальных ганглиях, миндалевидном теле, продолговатом мозге и задних рогах спинного мозга. Особый интерес представляла умеренная экспрессия мРНК TAAR1 в нескольких группах моноаминергических клеток, а именно в дорсальной зоне шва, голубом пятне и вентральной области покрышки [23].

В работе Bunzow J.R. et al. метод «Нозерн-блотт» тотальной РНК, полученной из различных областей мозга, а также гибридизация in situ срезов мозга крысы не выявили наличия TAAR1. Однако при использовании более чувствительного метода ОТ-ПЦР сигналы были обнаружены от РНК, полученной из различных областей мозга. С помощью этого полуколичественного метода было установлено, что сигнал, по-видимому, широко распространён по всему мозгу, с наивысшими уровнями экспрессии, обнаруженными в обонятельной луковице, обонятельном бугорке, префронтальной коре и других областях коры, в чёрной субстанции и вентральной покрышке среднего мозга, в некоторых областях мозжечка, моста и продолговатого мозга [24].

Для изучения физиологической роли TAAR1 in vivo Lindemann L. et al. был получен мутант мыши, в котором вся кодирующая последовательность TAAR1 была заменена репортерным геном, состоящим из гена LacZ, который кодирует бактериальную β-галактозидазу, и гена сигнала ядерной локализации (NLS). В целевом аллеле LacZ экспрессируется с использованием эндогенного промотора TAAR1, что обеспечивает чувствительный метод для изучения распределения TAAR1 в тканях [16]. Эксперименты с ОТ-ПЦР выявили низкий уровень экспрессии TAAR1 в мозге мышей. Окрашивание серийных срезов мозга взрослых особей с нокаутом TAAR1 и особей дикого типа выявило дискретное и специфичное расположение ядер, экспрессирующих TAAR1, преимущественно в дофаминергических и серотонинергических областях мозга; в частности, в гипоталамусе и преоптической области, вентральной области покрышки, миндалевидном теле, дорсальном ядре шва, ядре одиночного пути, в парагиппокампальной области (ринальной коре) и субикулюме. TAAR1 не обнаружили в обонятельной луковице и клетках Пуркинье [16].

В исследовании Revel F. et al., радиоактивная гибридизация in situ не позволила обнаружить уровни мРНК TAAR1 в мозге у мышей дикого типа. Чтобы более подробно изучить физиологическую роль TAAR1, авторами была создана генетически модифицированная линия мышей, в которой TAAR1 сверхэкспрессируется в нейронах. Однако данная модель не позволяет оценить распространение экспрессии TAAR1, так как у генетически модифицированных мышей она повышена, в том числе и в тех структурах, которые обычно не экспрессируют этот рецептор [25].

Таким образом, большинство исследований показывает, что по крайней мере в мозге TAAR1 экспрессируется на низком уровне. Однако эти данные противоречат более раннему сообщению Borowsky B., полученному с использованием нерадиоактивной гибридизации in situ. Такие расхождения могут быть результатом видовых и/или методологических различий и иллюстрируют сложности надёжного обнаружения экспрессии Taar1 [25].

Для изучения роли TAAR в процессе развития и созревания дофаминергических нейронов, экспрессия TAAR была проанализирована с помощью ПЦР TaqMan Realtime в различные временные точки дифференцировки трёх линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека (AD3, WTSIi004-A, WTSIi032-A) в дофаминовые нейроны. Авторы обнаружили лишь спорадическую экспрессию TAAR5 в анализируемых линиях клеток на всех этапах процесса дифференцировки и не обнаружили экспрессии каких-либо других типов TAAR [26]. Анализ когорты ИПСК человека HipSci, которые дифференцировали в нейроны среднего мозга, показал, что экспрессия TAAR1 может быть обнаружена на поздних стадиях дифференцировки (к 52-му дню) [26, 27].

В связи с успехами в разработке лекарственных препаратов, направленных на TAAR1, в последние годы предпринимались попытки визуализации рецептора в мозге in vivo с помощью методов позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Так, разработанный на основе антагониста TAAR1 лиганд [11C]TAAR1-1911 показывал высокую аффинность связывания с рецептором in vitro, но не мог использоваться in vivo из-за высокой скорости метаболической деградации [28]. Разработанный лиганд [18F]TAAR1-2203 продемонстрировал высокую метаболическую стабильность in vivo и позволил оценить занятость рецепторов in vivo с помощью ПЭТ в почках и поджелудочной железе. Интенсивность сигнала была заметно снижена у животных с нокаутом TAAR1. Однако специфического связывания с TAAR1 в ЦНС не наблюдалось, хотя [18F]TAAR1-2203, по-видимому, проникал через гематоэнцефалический барьер [2]. Эти результаты подчёркивают сложности визуализации TAAR1 в ЦНС в фоновых условиях.

Результаты проведённого нами анализа общедоступных баз данных экспрессии генов в клетках и тканях головного мозга подтверждают сообщения о низком уровне базовой экспрессии TAAR1 в клетках мозга. В связи с этим метод микрочипов не даёт возможности оценить экспрессию TAAR1 из-за того, что её уровень ниже уровня шума. Более перспективными для исследований являются методы секвенирования нового поколения, в особенности — одноклеточное и одноядерное секвенирование.

Сравнение данных «Allen Brain Cell Atlas» и «BrainSpan» показывает частичное пересечение структур, в которых была обнаружена экспрессия TAAR1. Это различные области коры больших полушарий, миндалевидный комплекс, гиппокамп, таламус. В то же время в мозге мыши, согласно данным «Whole Mouse Brain Transcriptomic Cell Type Atlas» паттерн экспрессии значительно отличался: наблюдалась экспрессия в клетках продолговатого мозга, среднего мозга, гипоталамуса. Ни в одном наборе не была обнаружена экспрессия TAAR1 в клетках мозжечка.

Экспрессия TAAR1 не была обнаружена на всех стадиях эмбрионального развития.

Обращает на себя внимание, что при проведении транскриптомной классификации и у человека, и у мыши большинство клеток, экспрессирующих TAAR1, принадлежат к одному кластеру. В обоих случаях это глутаматергические нейроны. Большинство нейронов, у которых найдена экспрессия TAAR1, по типу синапсов относились к глутаматэргическим, на втором месте были ГАМК-ергические нейроны. Недавние исследования показывают, что TAAR1 регулирует глутаматергическую передачу зависимым от состояния образом — снижая спонтанную нейронную активность и усиливая электрически вызванное высвобождение глутамата [3]. Хотя считается, что TAAR1 играет ключевую регуляторную роль в модуляции моноаминергической передачи, особенно в префронтальной коре головного мозга, и есть сообщения о том, что его мРНК локализуется в моноаминергических ядрах [29], в наборе Allen Brain Cell Atlas таких нейронов не оказалось.

Существенная вариабельность между источниками данных (различия в видах организмов, технологиях секвенирования, протоколах подготовки библиотек) не позволила нам провести статистический анализ или метаанализ. В связи с этим мы сосредоточились на систематическом обзоре публично доступных экспрессионных данных. Учитывая эти ограничения, для получения количественных оценок экспрессии использовались встроенные методы нормализации и подсчёта, доступные непосредственно в интерфейсах соответствующих баз данных. Качество картирования, показатели чтений, а также критерии фильтрации (минимальное число прочтений, метрики качества) не пересчитывались.

Потенциально значимый интерес представляют данные о протеомной экспрессии TAAR1 в тканях головного мозга; однако в ходе поиска не было выявлено баз данных, удовлетворяющих установленным критериям включения и исключения.

В целом TAAR1, по-видимому, гетерогенно распределён в центральной нервной системе, и характеризуется низким уровнем базальной экспрессии. В связи с этим для дальнейших исследований его экспрессии актуально использование новейших технологий одноядерного и одноклеточного секвенирования, а также разработка методов визуализации рецепторов in vivo. Анализ общедоступных баз данных экспрессии генов в клетках и тканях головного мозга выявил наличие клеток, экспрессирующих TAAR1 в таких структурах мозга человека, как кора больших полушарий, миндалевидный комплекс, базальные ядра, гиппокамп, таламус. Значительные расхождения в обнаруженных паттернах экспрессии в транскриптомных наборах человека и мыши указывают на возможность видовых различий в экспрессии TAAR1.

Материалы и данные Институт науки о мозге Аллена могут свободно использоваться для исследовательских целей с условием должного цитирования: