Экспериментальное исследование органопротекторной активности некоторых пептидных препаратов в условиях интоксикации, спровоцированной комплексом основных противотуберкулезных средств

Введение

Туберкулёз до настоящего времени остаётся непобеждённой, опасной и широко распространённой инфекцией, имеющей статус социально значимого заболевания. Наличие у возбудителя туберкулёза особой кислотоустойчивой оболочки способно защищать микобактерии от различных повреждающих факторов внешней среды, иммунной системы, а также от большинства известных химиотерапевтических средств. Кроме того, для возбудителя туберкулёза характерно быстрое формирование лекарственной устойчивости, а к особенностям патогенеза относится изначальная склонность заболевания к хроническому течению [1]. Совокупность отмеченных факторов в соответствии с принципами химиотерапии предопределяет необходимость длительного применения для лечения туберкулёза комбинации из нескольких химиотерапевтических средств с разными механизмами действия в расчёте на эффект потенцирования.

По эффективности все противотуберкулёзные средства подразделяются на три ряда, причём наиболее рациональным при отсутствии противопоказаний и лекарственной устойчивости считается назначение комбинации из двух основных противотуберкулёзных препаратов первого ряда: антибиотика — рифампицина и синтетического средства из группы гидразидов изоникотиновой кислоты — изониазида. Отмеченное сочетание до сих пор считается наиболее предпочтительным вариантом химиотерапии туберкулёза, хотя из-за стремительного распространения множественной лекарственной устойчивости фтизиатрам почти в 50% случаев приходится переходить на использование различных сочетаний резервных противотуберкулёзных средств второго ряда [2].

Во всех случаях длительной комбинированной химиотерапии помимо потенцирования основного противомикробного эффекта очень часто происходит и супрааддитивное усиление побочных эффектов. Применительно к комбинации рифампицин и изониазид, помимо нейротоксичности, чаще всего регистрируется усиление повреждающего влияния этих средств на функцию и структуру печени. По данным некоторых авторов, частота поражения печени при длительном назначении комбинации основных противотуберкулёзных средств первого ряда может достигать 50% случаев. На втором месте по частоте поражения паренхиматозных органов при проведении интенсивной противотуберкулёзной химиотерапии регистрируется нарушение функции почек [3, 4].

Начиная с последнего десятилетия XX века, стали чаще регистрироваться случаи лекарственных поражений поджелудочной железы. Лекарственная патология этого органа, спровоцированная применением основных противотуберкулёзных средств очень часто протекает под маской симптоматики со стороны других органов пищеварительной системы, и поэтому в официальной статистике в качестве побочного эффекта не всегда учитывается. Тем не менее, согласно некоторым клиницистам, лекарственное поражение поджелудочной железы, спровоцированное противотуберкулёзными средствами первого ряда в виде хронического панкреатита, может достигать 22,3% от общего числа пациентов фтизиатрического профиля [5, 6].

Таким образом, по частоте органотоксичности при лечении туберкулёза на первом месте регистрируется лекарственное поражение печени, на втором — почек, на третьем — поджелудочной железы. При этом почти в половине случаев возникает сочетанное поражение этих органов. Следует отметить, что из-за специфичного характера органотоксичности компонентов наиболее широко используемой противотуберкулёзной лекарственной комбинации первого ряда роль основного или потенцирующего агента с точки зрения органотоксичности может изменяться в зависимости от вида паренхиматозного органа. В частности, в отношении печени и поджелудочной железы основную органотоксичность проявляет изониазид, а нефротоксичность обычно связывают с повреждающим побочным эффектом рифампицина [7].

Фармакологическая защита структуры и функции паренхиматозных органов, поврежденных вследствие различных причин, включая ятрогенный фактор, как правило, предполагает задействование специализированных групп препаратов с органопротекторным действием. Причём наиболее часто в практической медицине используются гепатопротекторы, в то время как для защиты почек и поджелудочной железы арсенал органопротекторных средств очень ограничен, что отчасти обусловлено более редкой частотой поражения этих органов. При разработке новых органопротекторных средств, ориентированных на снижение органотоксичности противотуберкулёзных препаратов, следует учитывать, что длительная противотуберкулёзная химиотерапия в 80-90% случаев осложняется сразу несколькими разновидностями побочных реакций, включая сочетанное поражение паренхиматозных органов [4]. В связи с этим крайне желательно, чтобы новые органопротекторы обладали максимально возможной универсальностью, проявляющейся в одновременной защитной активности в отношении структуры и функции печени, почек и поджелудочной железы.

Одним из наиболее перспективных и при этом безопасных способов дальнейшего совершенствования фармакологической защиты паренхиматозных органов от различных токсических воздействий, включая побочные эффекты туберкулостатических средств, является экспериментальное выявление новых эффективных органопротекторов среди препаратов пептидной структуры [8].

В настоящее время в практической фтизиатрии в качестве иммуномодулятора с дополнительной гепатопротекторной активностью достаточно широко применяется пептидный препарат глутоксим. При этом важно подчеркнуть, что гепатопротекторный эффект этого средства запатентован именно применительно к противодействию гепатоксичности противотуберкулёзных препаратов [9]. Кроме того, имеются сообщения о нефропротективной активности глутоксима, которые базируются на данных клинических исследований, свидетельствующих о потенцировании этим средством терапевтического эффекта фозиноприла в отношении улучшения почечной гемодинамики в условиях диабетической нефропатии [10].

Представителем очень немногочисленной группы панкреопротекторных средств является пептидный препарат даларгин. В клинической практике это средство применяется в основном для лечения язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки, панкреатитов и панкреанекроза. В сочетании с октреотидом даларгин запатентован для лечения острого панкреатита [11]. При этом ряд исследователей в своих публикациях делают предположения о более широких возможностях применения этого синтетического аналога эндогенных опиатов. Однако сообщений об успешных попытках использования этого средства в качестве гепато- или нефропротектора в доступной научной литературе обнаружить не удалось.

Наиболее перспективным и при этом наиболее универсальным органопротектором пептидной природы, скорее всего, может считаться хорионический гонадотропин (ХГ). Из-за структурного сходства с лютеинизирующим гормоном гипофиза (ЛГ) препарат ХГ в практической медицине используют в основном в качестве заменителя ЛГ для лечения половых расстройств и проведения процедуры ЭКО. Однако, стоит обратить внимание на пока практически не используемую в клинике уникальную способность ХГ к стимуляции регенерации различных органов и тканей. Одним из первых исследователей этой уникальной активности ХГ является профессор из Нижнего Новгорода Солопаева И.М. Первоначально под её руководством проводились эксперименты и патентовались результаты исследований, свидетельствующие о способности ХГ к стимуляции регенерации печени [12], а затем была сформулирована более глобальная концепция о роли ХГ в качестве важнейшего гуморального фактора, стимулирующего рост, дифференцировку и регенерацию различных органов и тканей человека [13]. В 2011 году, на основании результатов углубленных гистохимических исследований, проведённых в США и Канаде, была доказана и запатентована способность ХГ к ускорению регенерации печени и почек, реализуемая через прямую стимуляцию стволовых полипотентных клеток [14]. Приоритетные экспериментальные исследования органопротекторной активности ХГ и других отмеченных пептидов в отношении одновременной защиты структуры и функции печени, почек и поджелудочной железы от токсического воздействия противотуберкулёзных средств первого ряда в течение 3-х предшествующих лет были проведены членами нашего авторского коллектива. Промежуточные результаты этих экспериментов публиковались исключительно в виде тезисов [15, 16]. Завершение экспериментальных работ в обозначенном направлении позволило нашему коллективу представить результаты этих исследований в данной статье в более развёрнутом и обобщенном виде.

Цель

 На модифицированной модели полиорганной патологии, спровоцированной комплексом основных противотуберкулёзных средств, произвести сравнительную экспериментальную оценку гепато-, нефро- и панкреопротекторной активности 3-х препаратов пептидной структуры (глутоксима, даларгина, хорионического гонадотропина).

Материалы и методы

Для экспериментальной оценки органопротекторной активности лекарственных средств в условиях применения противотуберкулёзных препаратов первого ряда чаще всего используется модель повреждения печени, предложенная в 1989 году Сливкой Ю.И., предполагающая двухнедельное введение лабораторным крысам комбинации изониазида, рифампицина и пиразинамида [17]. В ходе предварительных исследований при попытках точного воспроизведения этой модели мы неоднократно сталкивались с ситуацией почти полного отсутствия морфологического подтверждения поражения печени у подопытных крыс, что, согласно исследованиям Можокиной Г.Н. [18], могло быть объяснено неоднозначным влиянием пола, возраста и генетических особенностей задействованных лабораторных крыс в отношении фармакокинетики изониазида. В связи с этим, для проведения данного эксперимента было решено усилить повреждающее влияние отмеченного способа моделирования токсического гепатита с возможным распространением органотоксичного влияния на почки и поджелудочную железу. Применённая нами модификация отмеченного известного способа моделирования патологии заключалась в двухкратном увеличении дозировки изониазида, увеличении срока воздействия до 3 недель, а также в замене пиразинамида на этанол, задействованного в качестве фактора потенцирующего органотоксичность. При этом были приняты во внимание известные факты о потенцировании алкоголем токсичности изониазида [19], а также опыт других исследователей, уже применявших ранее этанол для потенцирования в эксперименте на крысах органо-токсического воздействия на печень со стороны резервных противотуберкулёзных средств [20].

 Объектом исследования в данном эксперименте послужили 100 белых крыс-самцов, массой 230-250 г, из которых 20 животных были интактными, а остальные 80 особей были разделены на 4 опытных группы и в течение трёх недель внутрижелудочно получали изониазид в дозировке 100 мг/кг, рифампицин 125 мг/кг, а также внутрибрюшинно 25% раствор этанола в дозировке 3 г/кг. В качестве экспериментальной фармакотерапии животные первой опытной группы получали глутоксим в дозировке 40 мг/кг, во второй группе — даларгин 0,15 мг/кг, в третьей группе — ХГ 500 МЕ/кг. Четвёртая группа опытных крыс была контрольной и получала инъекции изотонического раствора хлорида натрия. Все препараты вводились ежедневно подкожно в объёме 0,1 мл на 100 г. Все животные, задействованные в эксперименте, содержались в помещении вивария при температуре воздуха 22-24°С, световом режиме: 12 часов — свет, 12 часов — темнота. Они получали стандартный гранулированный корм и воду в свободном доступе с соблюдением всех правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, в соответствии с действующими «Правилами лабораторной практики» и «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». На момент начала выполнения эксперимента все животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования не выявлено. Наблюдение за животными, включая ежедневный учет летальности подопытных крыс, проводилось в течение трёх недель. На 22-й день опыта всех интактных крыс, а также выживших опытных животных умерщвляли путём обескровливания под прикрытием ветеринарного препарата «Золетил». В момент эвтаназии у лабораторных крыс отбиралась кровь из сонной артерии для проведения общего и биохимического анализа, осуществлявшегося в специализированной ветеринарной лаборатории «ВетЮнион» (г. Москва).

По результатам общего и биохимического анализов крови производилась оценка функционального состояния паренхиматозных органов. Функциональное состояние печени оценивали по ряду стандартизированных биохимических показателей крови, которые объединялись по функциональным группам: маркеры цитолиза гепатоцитов (активность аспартаттрансаминазы — АСТ, аланинтрансаминазы — АЛТ и лактатдегидрогеназы — ЛДГ), показатели синтетической активности и белкового обмена (сывороточная холинэстераза — ХЭ, альбумины), липидного обмена (содержание триглицеридов, общего холестерина, в также холестерина липопротеидов низкой плотности — ХС ЛПНП и холестерина липопротеидов высокой плотности — ХС ЛПВП), дезинтоксикационной функции печени (прямой билирубин) и уровень холестаза (активность щелочной фосфатазы — ЩФ и ГГТ — гамма-глутамилтрансферазы, уровень общего билирубина). Функциональное состояние почек оценивали по показателям выделительной функции (уровень в крови креатинина и мочевины) и интенсивности синтеза почечного эритропоэтина (количество эритроцитов и гемоглобина). Функциональным показателем деятельности эндокринного части поджелудочной железы был уровень глюкозы крови, а о деятельности экзокринного отдела этого органа судили по активности в крови липазы и альфа-амилазы панкреатической.

Для осуществления морфологических исследований у всех животных производили забор образцов ткани печени, почек и поджелудочной железы. Кусочки тканей толщиной 1/0,5 см вырезали из различных участков указанных органов. Взятый материал для исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, по Масону на коллагеновые волокна и фукселином по Харту на эластические волокна. Стереометрическое исследование печени, почек и поджелудочной железы проводили для определения соотношений различных тканевых компонентов этих органов. С помощью метода точечного счета в печени определяли удельную площадь гепатоцитов, синусоидов и стромы, в почках выявляли удельную площадь почечных телец, канальцев и стромы, а в поджелудочной железе — ацинусов, островков Лангерганса и стромы. Количество точек, попавших на определенный тканевой компонент, приравнивалось к процентному содержанию его в общей структуре указанных органов, принятой за 100%. Цифровой материал обрабатывали с помощью программы STATISTICA (версия 6) с использованием t-критерия Стьюдента с поправкой для множественных сравнений. Цифровые данные проверяли на нормальность распределения. Результаты считали достоверными, если ошибка средней не превышала 5% (р <0,05).

Результаты

Примененная методика моделирования исследуемой патологии с задействованием повышенных дозировок основных противотуберкулёзных средств в сочетании с алкоголем оказалась очень токсичной и сопровождалась в контроле гибелью 70% животных. Применение исследуемых препаратов позволило существенно повысить выживаемость подопытных крыс, что свидетельствовало о наличии у этих средств достаточно выраженной антитоксической активности. В частности, применение даларгина повышало выживаемость по сравнению с контролем в 1,7 раза, а назначение глутоксима и ХГ способствовало повышению этого показателя в 2,2 и 2,3 раза соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Влияние экспериментальной фармакотерапии на выживаемость подопытных крыс при 3-х недельной интоксикации туберкулостатиками в сочетании с алкоголем.

Согласно результатам биохимического анализа крови трехнедельное воздействие комбинации изониазида, рифампицина и этанола провоцировало у подопытных крыс серьезные функциональные нарушения со стороны всех трёх исследуемых органов, но сильнее всего ожидаемо страдала печень. В частности, анализ динамики активностей цитолитических ферментов в крови показал, что на фоне смоделированной патологии отмечалось достоверное повышение активности АСТ, АЛТ и ЛДГ на 148, 66 и 172% соответственно (табл. 1). Повышению активностей цитолитических ферментов в крови полноценно препятствовал только глутоксим, в то время как лечебная эффективность ХГ и даларгина была выражена в меньшей степени.

Важно отметить, что синтез альбуминов и сывороточной холинэстеразы (ХЭ) осуществляется только в печени. У контрольных крыс 21-дневная смоделированная патология вызывала в крови достоверное снижение уровня альбуминов на 46%, а активности ХЭ на 37%, что чётко свидетельствует о нарушении белкового синтеза в гепатоцитах (табл. 2). Из примененных препаратов только введение глутоксима нормализовало часть нарушенных показателей.

Смоделированная интоксикация вызывала у контрольных животных повышение активности ЩФ и ГГТ в 3,86 и 7,05 раз по сравнению с интактными крысами, что свидетельствовало о провокации выраженного холестаза (табл. 3). Кроме того, был зафиксирован резкий подъём концентрации общего и прямого билирубина в 10,21 и 15,08 раз, что подтверждало развития холестаза и свидетельствовало об интенсивном воспалительном процессе и гибели гепатоцитов. Курсовое применение исследуемых средств существенно снижало интенсивность воспаления, причём наиболее эффективными оказались ХГ и глутоксим.

Согласно результатам общего и биохимического анализов крови помимо печени смоделированная патология провоцировала у лабораторных крыс выраженные нарушения со стороны функции почек. У контрольных животных это проявлялось достоверным ростом концентрации мочевины и креатинина крови на 100 и 55%, свидетельствующим о нарушении выделительной функции почек и провокации воспаления в этом органе (табл. 4).

Кроме того, интоксикация туберкулостатиками в сочетании с воздействием алкоголя вызывала нарушение в почках синтеза эритропоэтина, что проявилось в снижении в общем анализе крови количества эритроцитов и концентрации гемоглобина, которые снизились у контрольных животных на 42 и 36% соответственно. Способность к эффективной нормализации показателей красной крови, зависимых от уровня эритропоэтина удалось проявить только ХГ. Этот же препарат наиболее эффективно способствовал нормализации уровня мочевины и креатинина, хотя глутоксим и отчасти даларгин также вызывали достоверно значимые положительные сдвиги в отношении этих показателей, характеризующих выделительную функцию почек.

Воздействие смоделированной патологии негативно отразилось и на функционировании поджелудочной железы. При этом страдал как эндокринный, так и экзокринный отделы этого органа, что у контрольных животных выразилось в повышении глюкозы крови на 66%, а также в угнетении активностей амилазы и липазы на 24 и 54% соответственно (табл. 5). Достоверной органопротекторной активностью в отношении защиты функций поджелудочной железы обладали ХГ и даларгин, причём эффективность последнего препарата проявилась более отчетливо, хотя активность липазы даларгин не восстанавливал, что согласуется с данными некоторых клиницистов, исследовавших особенности цитопротекторного эффекта этого средства при проведении лечения постгастрорезекционного панкреатита [21].

Гистологическое исследование ткани печени контрольных крыс показало, что смоделированная патология провоцировала в этом органе грубые альтернативные и воспалительные изменения, которые выражались в развитии дискомплексации печёночных балок, диффузной гидропической и баллонной белковой, а также крупнокапельной жировой дистрофии гепатоцитов (рис. 2, А). В расширенных портальных трактах определялась выраженная воспалительная лимфоцитарная инфильтрация, но, при этом, не распространяющаяся в дольки, что указывает на наличие межуточного гепатита низкой степени активности. Лечение даларгином приводило к частичному сохранению гистоархитектоники печени, хотя, в отдельных дольках, всё ещё наблюдалась дискомплексация трабекул. В печёночных клетках отмечалась морфологическая картина очаговой белковой гидропической дистрофии (рис. 2, В), а в строме — проявления межуточного гепатита, как и в контрольной серии. Фармакотерапия глутоксимом приводила к нормализации структуры органа с сохранением балочного строения. В отдельных гепатоцитах всё ещё сохранялась картина гидропической белковой дистрофии, но подавляющее большинство клеток не имело дистрофических изменений (рис. 2, С). В портальных трактах определялись не диффузные, а рассеянные, скудные лимфоцитарные инфильтраты, т.е. межуточное воспаление, по сравнению с контрольной серией, было выраженно значительно меньше. Применение у крыс в качестве фармакотерапии ХГ приводило к полному восстановлению структуры печени без дистрофических изменений (рис. 2, D). Значительная часть портальной стромы не имела воспалительной инфильтрации, лишь изредка в ней определялись небольшие скопления лимфоцитов, т.е. межуточное воспаление присутствовало в минимальной степени, по сравнению с контрольной серией.

Рис. 2. Структурные изменения печени в контроле (А), при применении даларгина (В), глутоксима (С) и ХГ (D)

Окраска гематоксилин-эозином (A, B, C) и по Масону (D) с использованием бриллиантового зелёного, (х200 — А,C,D; х160 — D). А — крупнокапельная жировая дистрофия гепатоцитов. В — очаговая белковая гидропическая дистрофия гепатоцитов. С — нормальная структура печени, отсутствие дистрофических изменений в гепатоцитах. D — портальный тракт с полнокровием ветви воротной вены, без воспалительной инфильтрации; гепатоциты — без дистрофических изменений.

Стереометрическое исследование печени в контрольной серии показало (рис. 3), что удельная площадь, занимаемая гепатоцитами, по сравнению с интактной серией, уменьшалась в 1,2 раза (p=0,05), а площадь синусоидов и стромы, наоборот, увеличилась в 1,1 раза (p=0,05), что количественно отражает развитие повреждения и межуточного воспаления. При лечении даларгином, удельная площадь гепатоцитов, синусоидов и стромы, по сравнению с контрольной серией, менялись недостоверно. При проведении стереометрии в серии с глутоксимом удалось установить, что удельная площадь гепатоцитов, по сравнению с контрольной серией, увеличивалась в 1,1 раза (р=0,05), синусоидов менялась недостоверно, а площадь, занимаемая стромой уменьшалась в 1,4 раза (р=0,001), что объективно отражает уменьшение воспалительной реакции. Стереометрическое исследовании в серии с ХГ показало, что удельная площадь гепатоцитов, по сравнению с контрольной серией, увеличивалась в 1,1 раза (р=0,05), синусоидов менялась недостоверно, а площадь, занимаемая стромой уменьшалась в 1,4 раза (р=0,001), также как и в серии с глутоксимом.

Рис. 3. Влияние экспериментальной фармакотерапии на стереометрию ткани печени

Примечания: * — достоверная разница по отношению к интактным (р <0,05); ** — достоверная разница по отношению к контролю (р <0,05).

При гистологическом исследовании почек животных контрольной серии клетки эпителия проксимальных и дистальных извитых канальцев находились в состоянии белковой гидропической, гиалиново-капельной дистрофии и коагуляционного некроза, по сравнению с интактной группой животных (рис. 4, А). Просветы канальцев были резко расширены и заполнены эозинофильным белковым и некротическим материалом (рис. 4, А), гиалиновыми цилиндрами, а также базофильными отложениями извести со скоплениями сегментоядерных нейтрофилов. Кроме того, в почечной ткани выявлялся гломерулосклероз и склероз стромы, в которой также определялась диффузная воспалительная лимфоцитарная инфильтрация (межуточный нефрит). Клубочки выглядели нормальными. При использовании даларгина тубулярный аппарат почек соответствовал структурным изменениям контрольной серии. Это выражалось в том, что эпителиоциты главных отделов нефрона находились в состоянии гиалиново-капельной и гидропической дистрофии с некрозом отдельных клеток (рис. 3, В). Строма почек коркового и мозгового слоев характеризовалась сохранением межуточного воспаления. Клубочки также не изменялись. При лечении глутоксимом эпителиоциты проксимальных и дистальных извитых канальцев находились в состоянии гидропической дистрофии с вакуолизацией цитоплазмы (рис. 4, С). Кроме того, в данной серии, гиалиново-капельной дистрофии и некроза, обнаружено не было. В строме почек обнаруживались очаговые лимфоцитарные инфильтраты, но диффузной инфильтрации отмечено не было. Лечение с применением ХГ приводило к практически полной нормализации структуры почек. В клетках эпителия проксимальных и дистальных извитых канальцев не выявлялась гиалиново-капельная дистрофия, а также признаки коагуляционного некроза. Однако, гидропическая дистрофия всё же выявлялась в отдельных эпителиоцитах (рис. 4, D). В строме почек встречались редкие и небольших размеров скопления лимфоцитов.

Рис. 4. Структурные изменения почек в контроле (A), при применении даларгина (В), глутоксима (С) и ХГ (D)

Окраска гематоксилин-эозином, (х200 — А, В, D; х160 — C). А — гидропическая и гиалиново-капельная дистрофия эпителия извитых канальцев с переходом в некроз (кариолизис), просветы канальцев переполнены белковым эозинофильным материалом; клубочек — неизменен. В — гидропическая и гиалиново-капельная дистрофия эпителия извитых канальцев с переходом в некроз (кариолизис), просветы канальцев переполнены белковым эозинофильным материалом. С, D — гидропическая дистрофия отдельных клеток эпителия извитых канальцев, клубочки — неизменённые.

Стереометрическое исследование почечной ткани в контрольной группе показало, что удельная площадь почечных телец, по сравнению с интактными животными, уменьшалась в 1,4 раза (р=0,001), а площадь, занимаемая канальцами, менялась недостоверно (рис. 5). При этом площадь стромы увеличивалась в 1,3 раза (р=0,001), объективно подтверждая развитие выраженного межуточного воспаления и склероза. Лечение даларгином сопровождалось тем, что удельная площадь тканевых структур почек, также как и в отношении печени, менялись недостоверно. Стереометрическое исследование в группе с глутоксимом показало, что удельная площадь почечных телец и канальцев менялась недостоверно, а площадь стромы канальцев уменьшалась в 1,2 раза (р=0,05). В группе с ХГ удельная площадь почечных телец увеличивалась в 1,3 раза (р=0,001), канальцев уменьшалась, но изменения носили недостоверный характер, при этом , площадь стромы уменьшалась в 1,3 раза (р=0,001).

Рис. 5. Влияние экспериментальной фармакотерапии на стереометрию ткани почек

Примечания: * — достоверная разница по отношению к интактным (р <0,05); ** — достоверная разница по отношению к контролю (р <0,05).

При гистологическом исследовании поджелудочной железы контрольных крыс было отмечено, что большинство островков Лангерганса подвергались атрофии и склерозу, а отдельные островки были гипертрофированы. Выявлялись очаговые некротические изменения ацинусов с вовлечением в процесс междольковой и перипанкреатической клетчатки (рис. 6, А). При фармакотерапии даларгином, в отличие от гистологической картины в печени и почках, в поджелудочной железе отмечалось нормализация структуры. Так, в дольках не выявлялись деструктивные изменения в ацинусах и отсутствовало реактивное воспаление. Островки Лангерганса имели различную форму и размеры, сохранялся сегментарный склероз междольковой стромы (рис. 6, В). Междольковая и внутридольковая строма была инфильтрирована единичными лимфоцитами, что указывало на значительное уменьшение степени межуточного воспаления в органе. При использовании глутоксима в поджелудочной железе подопытных животных структурные изменения не отличались от контрольных. В частности, островки Лангерганса уменьшались в размерах, просветы ацинусов расширялись и заполнялись секретом. В дольках отмечались некротические изменения (рис. 6, С). Внутридольковая и междольковая строма поджелудочной железы была увеличена, диффузно инфильтрирована лимфоцитами и сегментоядерными лейкоцитами, а также в ней наблюдалось разрастание грубоволокнистой соединительной ткани. Лечение ХГ в поджелудочной железе крыс сопровождалось нормальными размерами островков Лангерганса, отсутствием некротических изменений в дольках, просветы ацинусов имели обычный вид. Внутридольковая и междольковая строма поджелудочной железы была несколько увеличена, умеренно инфильтрирована лимфоцитами (рис. 6, D).

Рис. 6. Структурные изменения поджелудочной железы в контроле (A), при применении даларгина (В), глутоксима (С) и ХГ (D)

Окраска гематоксилин-эозином, (х160 — А,В,С; х200–D). А — некрозы долек с ацинусами и междольковой стромы. В — умеренная лимфоцитарная инфильтрация междольковой стромы и склероз. С — некрозы долек с ацинусами и междольковой стромы. D — нормальная структура железы и островком Лангерганса и неизмененными ацинусами.

По результатам стереометрии тканевых структур поджелудочной железы (рис. 7) в контрольной серии удалось установить, что удельная площадь островков Лангерганса уменьшалась в 1,3 раза (р=0,05), а площадь, занимаемая стромой возрастала в 1,3 раза (р=0,05), отражая также развитие воспалительной реакции в интерстиции. Удельная площадь ацинусов менялась недостоверно, по сравнении с интактными животными. В группе с даларгином удельная площадь островков Лангерганса увеличивалась в 1,7 раза (р=0,001), а площадь, занимаемая стромой, уменьшалась в 1,5 раза (р=0,001), что отражает уменьшение воспалительной реакции и восстановление структуры органа. При этом удельная площадь ацинусов менялась недостоверно. Лечение глутоксимом приводило к тому, что удельная площадь островков Лангерганса и ацинарного аппарата менялась недостоверно, а площадь стромы уменьшалась в 1,2 раза (р=0,05), по сравнению с контрольной серией. В группе с ХГ удельная площадь островков Лангерганса увеличивалась в 1,4 раза (р=0,001), площадь стромы уменьшалась в 1,2 раза (р=0,05), а площадь ацинусов менялась недостоверно, по сравнению с контрольной серией.

Рис. 7. Влияние экспериментальной фармакотерапии на показатели стереометрии ткани поджелудочной железы

Примечание: * — достоверная разница по отношению к интактным (р <0,05).

Заключение

В результате проведённого исследования было установлено, что применённая в данном эксперименте методика моделирования у лабораторных крыс трехнедельной интоксикации комплексом основных противотуберкулёзных средств: изониазида (100 мг/кг) и рифампицина (125 мг/кг) с дополнительными ежедневными внутрибрюшинными инъекциями 25-процентного раствора этанола в качестве потенцирующего органотоксичность фактора в дозировке 3 г/кг вызывала у подопытных животных сильную интоксикацию, завершившуюся смертельным исходом у 70% нелеченных (контрольных) особей. У выживших к моменту окончания эксперимента лабораторных животных по данным биохимического анализа крови и углубленных гистологических исследований было зафиксировано возникновение токсической полиорганной патологии, сопровождающейся грубыми структурными и функциональными нарушениями со стороны трёх паренхиматозных органов: печени, почек и поджелудочной железы, обусловленные выраженным хроническим воспалительным процессом. Применённый вариант моделирования полиорганной патологии принципиально может быть задействован в доклинических исследованиях по испытанию новых органопротекторных средств, эффективность которых должна в этом случае оцениваться по предотвращению летальности и степени обратимости патологических сдвигов и индикаторных биохимических параметров, и структурных изменений в отмеченных органах по результатам гистологических исследований. При этом для уменьшения количества задействованных лабораторных животных в будущем, вероятно, имеет смысл снизить процент летальности в контроле до 40-50% за счёт снижения дозировки этанола и изменения пути его введения с внутрибрюшинного на внутрижелудочный.

Апробация данной модели полиорганной патологии позволила получить экспериментальное доказательство целесообразности расширения показаний для глутоксима и даларгина по их использованию в качестве органопротекторных средств при проведении комплексного лечения туберкулёза. Кроме того, был получен комплект экспериментальных данных, обосновывающих хорошие перспективы по инициации доклинических испытаний препарата ХГ по дополнительному показанию в качестве эффективного и достаточно универсального органопротекторного препарата.

Выводы

1. Все 3 исследованных препарата в условиях длительного воздействия токсических дозировок противотуберкулёзных средств первого ряда — изониазида и рифампицина в сочетании с дополнительным потенцирующим фактором в виде хронической алкогольной интоксикации проявили достаточно выраженный органопротекторный эффект, причём в отношении гепатопротекции средства расположились в следующем ряду: глутоксим = ХГ > даларгин; в отношении нефропротективной активности: ХГ > глутоксим > даларгин; в отношении защиты поджелудочной железы: даларгин > ХГ > глутоксим.
2. Результаты эксперимента подтвердили целесообразность задействования в комплексной противотуберкулёзной терапии органопротекторных свойств глутоксима и даларгина, а также свидетельствовали о перспективности применения ХГ по новому назначению в качестве универсального органопротектора для предупреждения органотоксичности основных противотуберкулёзных средств.