Разработка раневого покрытия на основе модифицированного пенополиуретана для локализации действия бактериофага в ране

Введение

Проблема антимикробной резистентности является одним из главных вызовов современной медицины, что обусловливает необходимость поиска альтернативных методов борьбы с бактериальными инфекциями. Бактериофаги представляют собой перспективное направление в лечении инфекционных заболеваний, особенно при терапии раневых инфекций [1]. Однако применение бактериофагов в клинической практике сопряжено с рядом технологических проблем, ключевыми из которых являются способы их доставки в очаг инфекции и поддержание их терапевтической концентрации в зоне клинического интереса [2].

Эффективность местной фаготерапии определяется соблюдением принципов, разработанных на основании экспериментальных и клинических исследований последних лет. Одним из основных требований является создание в зоне клинического интереса концентрации фагов, превышающей пороговое значение C = 10⁸-10⁹ БОЕ/мл, что в 100 раз превышает концентрацию бактерий-мишеней [2]. Для достижения этой цели перспективным является использование полимерных материалов в качестве носителей бактериофагов [3].

Пенополиуретан является потенциальным материалом для создания раневых покрытий благодаря своей пористой структуре, эластичности и биосовместимости [4]. Однако исходный пенополиуретан обладает гидрофобными свойствами, что ограничивает его применение для раневых покрытий, требующих активного впитывания экссудата. Модификация поверхности пенополиуретана является перспективным подходом для придания материалу гидрофильности, адгезивных и антибактериальных свойств [5, 6, 7].

В качестве реакции модификации была использована окислительная полимеризация производных катехоламинов, в результате которой было сформировано на поверхности биомиметическое покрытие с уникальными свойствами [7]. Наличие свободных гидроксильных и аминогрупп обеспечивает адгезивные свойства и возможность иммобилизации биологически активных агентов, включая антибиотики и бактериофаги [8].

Цель данной работы заключалась в разработке прототипа раневого покрытия на основе модифицированного пенополиуретана для иммобилизации бактериофагов и обеспечения их контролируемого высвобождения в ране. 

Материалы и методы

В работе использовали: технический пенополиуретан (Синтез ОКА); бактериофаг стафилококковый «Стафилофаг» производства филиала АО НПО «Микроген» в г. Н. Новгород «ИМБИО», стерильный очищенный фильтрат фаголизатов бактерий рода Staphylococcus с активностью по Аппельману не менее 10⁻⁵; трис-(гидроксиметил)-аминометан (Pharmpur^®, Ph Eur, BP, Scharlab, Испания); изотонический раствор NaCl (OOO «Гротекс», Россия); культуру Staphylococcus aureus, клинический штамм №229 из рабочей коллекции бактериологической лаборатории Университетской клиники «ПИМУ», выделенный от пациента с ожоговыми ранами; агар ГРМ.

Модификация пенополиуретана. Вырезали пластины из технического полиуретана размером 2×2×0,5 см. Модификацию пластин пенополиуретана проводили методом окислительной полимеризации производных катехоламинов. Готовили 0,01 М раствор трис-(гидроксиметил)-аминометана, в который добавляли дофамина гидрохлорида в концентрации 2 мг/мл. Значение pH раствора доводили до 8,6 для инициации полимеризации. Образцы пенополиуретана полностью погружали в полученный раствор и выдерживали при комнатной температуре на воздухе при естественном освещении в течение 24 часов. После полимеризации образцы промывали дистиллированной водой, а затем высушивали в сухожаровом шкафу при температуре 45°C в течение 4 часов. Успешность модификации оценивали визуально по характерному изменению цвета материала до темно-коричневого и чёрно-коричневого (по классификации RAL), возможно наличие неравномерной окраски («мраморности»).

Определение физико-химических свойств

Определение поглотительной способности по массе. Образцы пенополиуретана стандартной формы (пластины в форме параллелепипеда) взвешивали на аналитических весах (m₀, г) и погружали в дистиллированную воду на 10 минут. После удаления избытка воды образцы повторно взвешивали (m₁, г). Поглотительную способность рассчитывали по следующей формуле:

B = (m₁ - m₀) / m₀ × 100% (1), где  

B – поглотительная способность материала по массе, %;

m₁ – масса образца материала после поглощения им воды, г;

m₀ – масса исходного материала, г.

Все измерения проводились в шести повторах.

Определение поглотительной способности по объёму. Измеряли исходный объём образца (V₀), после чего образец полностью пропитывали в дистиллированной воде. По разнице объёмов определяли количество впитанной жидкости (V_впит) и рассчитывали коэффициент поглощения по следующей формуле:

K = (V_впит / V₀) × 100%, где

К – коэффициент водопоглощения материала,%;

V_впит – объем поглощенной жидкости образцом материала, см³/мл;

V₀ – исходный объем образца, см³/мл.

Все измерения проводились в шести повторах.

Определение пористости. Образцы взвешивали (m₀, г), полностью пропитывали дистиллированной водой и взвешивали повторно (m₁, г). Пористость рассчитывали по следующей формуле:

П = (m₁ - m₀) / V_H₂O × 100%, где

П – пористость материала, %;

m₀ – масса исходного образца материала, г;

m₁ – масса образца материла, после его полной пропитки жидкостью, г;

V_H₂O – объём воды, необходимый для полного пропитывания образца.

Все измерения проводились в шести повторах.

Определение времени поглощения (имбибиции) капли. На поверхность образца с помощью микродозатора наносили каплю дистиллированной воды объёмом 10 мкл. Секундомером фиксировали время полного впитывания капли. Для всех показателей результатом являлось среднее арифметическое значение не менее пяти измерений.

Диализ бактериофагов по методу Крувчинского. Исследование кинетики высвобождения бактериофагов проводили методом диализа по Крувчинскому через полупроницаемую мембрану. В диализную трубку, закрытую с одной стороны целлюлозной мембраной, помещали пенополиуретановую пластину, пропитанную бактериофагом. Трубку погружали в изотонический раствор NaCl и инкубировали при температуре 37°C. Пробы отбирали через 1, 3, 5 и 8 часов диализа, доводя объём среды до исходного значения после каждого отбора.

Оценка жизнеспособности бактериофагов на модифицированной пенополиуретановой подложке. Образцы пенополиуретана пропитывали бактериофагом в количестве, равном ¹/₂ от максимального объёма впитывания. Пропитанные образцы помещали в чашки Петри с ГРМ-агаром, на который предварительно наносили суспензию микроорганизмов S. aureus концентрацией 1×10⁵ КОЕ/мл (соответствует оптической плотности 0,5-0,6 единиц по шкале МакФарланда). Чашки инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов. Степень лизиса оценивали по пятибалльной шкале:

• «-» – отсутствие литической активности;
• «+» – низкая активность;
• «++» – зона лизиса с большим количеством колоний вторичного роста;
• «+++» – зона лизиса с единичными колониями вторичного роста;
• «++++» – прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста;

Процедура выполнялась в трёх повторениях для обеспечения репрезентативности полученных данных и минимизации случайных погрешностей.

Анализ кинетики литической активности бактериофагов. Готовили суспензию S. aureus концентрацией 1×10⁵ КОЕ/мл (соответствует оптической плотности 0,5-0,6 единиц по шкале МакФарланда) и равномерно наносили на подсушенные чашки Петри с ГРМ-агаром. Из проб, полученных в ходе диализа (1, 3, 5 и 8 часов), отбирали по 20 мкл диализата и наносили на чашки. Отбор проб проводили в трехкратной повторности для каждой экспериментальной точки. Чашки инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов, после чего оценивали степень лизиса.

Определение титра бактериофага по методу Аппельмана. Готовили 12 стерильных бактериологических пробирок с 4,5 мл стерильного питательного бульона. В 1-ю пробирку стерильной пипеткой вносили 0,5 мл исследуемого фага. Содержимое пробирки перемешивали и 0,5 мл из 1-й пробирки переносили во 2-ю, перемешивали и из 2-й пробирки переносили в 3-ю и т.д. до 10-й включительно. Из 10-й пробирки 0,5 мл удаляли. 11-я и 12-я пробирки являлись контрольными (пробирка 11 – контроль роста микроорганизма, содержащая 4,5 мл бульона и 0,2 мл бульонной культуры S. aureus; пробирка 12 – контроль стерильности питательного бульона, содержащая 4,5 мл бульона без добавления бактериальной культуры S. aureus и бактериофага). Получали разведения бактериофага от -10 до – 10 000 000 000 (10^-1 – 10^-10). Далее во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вносили по 0,2 мл 18–24-часовой бульонной культуры бактерий S. aureus, чувствительных к титруемому бактериофагу. Штатив с пробирками инкубировали в термостате при 37°С. Учет результатов производили через 18–20 часов. Титром считали максимальное разведение бактериофага, при котором наблюдался полный лизис чувствительной к фагу культуры S. aureus.

Статистический анализ. При подтверждении нормального распределения использовали для анализа параметрический метод сравнения данных (Т-критерий для двух независимых выборок). В случае если данные не соответствуют нормальному распределению использовали непараметрический метод сравнения выборок (критерий Манна-Уитни). Значимость различий определялась при уровне значимости p <0,05.

Результаты и обсуждение

Влияние модификации на физико-химические свойства пенополиуретана.   Результаты оценки поглотительной способности представлены в табл. 2. По массе поглотительная способность пенополиуретана (ПУ) составила 3459,6 ± 197,8%, модифицированного пенополиуретана (МПУ) – 3395,7 ± 205,26%. По объёму для ПУ получено значение 217 ± 22,72%, для МПУ – 213,42 ± 23,3%. Тенденция незначительного снижения влагоёмкости МПУ связано с уменьшением размера пор вследствие адсорбции продуктов полимеризации производных катехоламинов, что согласуется с данными по пористости (табл. 1).

Результаты определения пористости представлены в таблице 2. Для ПУ средняя пористость составила 97,04 ± 0,86%, для МПУ – 95,36 ± 4,29%. Снижение пористости МПУ можно объяснить адсорбцией продуктов окислительной полимеризации производных катехоламинов на поверхности пор, что приводит к уменьшению их эффективного диаметра.

Время имбибиции одной капли дистиллированной воды объёмом 10 мкл является показателем гидрофильности материала. Для ПУ среднее время впитывания составило 53 мин 48 с ± 14 мин 6 с, что свидетельствует о выраженных гидрофобных свойствах материала. После модификации ПУ время впитывания статистически значимо сократилось до 4,3 ± 2,44 секунд (p <0,05), что указывает на приобретение материалом выраженных гидрофильных свойств.

Полученные результаты оценки физико-химических свойств демонстрируют, что модификация кардинально изменяет поверхностные свойства ПУ, превращая гидрофобный материал в модифицированный с гидрофильными свойствами (МПУ). Это имеет важное значение для применения в качестве раневого покрытия, поскольку обеспечивает эффективное впитывание раневого экссудата.

Оценка жизнеспособности и литической активности бактериофагов на пенополиуретановых пластинах. МПУ демонстрировал максимальную литическую активность («++++») во все временные точки диализа (1, 3, 5 и 8 часов), что свидетельствует о полном сохранении жизнеспособности бактериофагов. Для ПУ максимальная активность наблюдалась только в первые 3 часа, в то время как на 5 и 8 часах диализа отмечалось снижение активности («++» и «++» соответственно) с образованием зоны лизиса с большим количеством колоний вторичного роста (табл. 3).

Полученные результаты указывают на то, что модификация не только не снижает, но и способствует сохранению жизнеспособности бактериофагов при их иммобилизации и последующем высвобождении.

Титрование бактериофагов. Результаты определения титра бактериофага по методу Аппельмана для ПУ и МПУ представлены в табл. 4 и 5.

Данные титрования показывают, что в пробах бактериофага, высвобожденного из МПУ, полный лизис бактериальной культуры наблюдался при всех исследованных разведениях (до 10⁻⁵) на всех временных точках. Это свидетельствует о сохранении высокой литической активности бактериофагов на уровне не ниже 10⁵ БОЕ/мл.

В случае ПУ уже через 3 часа диализа титр бактериофага снижался до 10 ³, через 5 часов – до 10 ², а к 8 часам наблюдался рост S. aureus при всех разведениях, что указывает на практически полную утрату литической активности.

Полученные результаты демонстрируют, что МПУ обеспечивает длительное сохранение жизнеспособности и литической активности иммобилизованных бактериофагов, что является критически важным для применения в качестве раневого покрытия. Вероятно, модифицирующее покрытие на ПУ создаёт протективную микросреду для бактериофагов, защищая их от денатурации и потери активности.

Ограничения исследования

Ограничением данного исследования явилось его проведение in vitro. Статическая, равно как и простая динамическая модель in vitro, не учитывает активный транспорт веществ, метаболическую активность тканей и влияние ферментных систем. В отличие от живого организма, здесь отсутствует кровоток и лимфодренаж, которые постоянно поддерживают градиент концентрации. Также модель ограничена использованием стандартизированных буферных растворов. В реальных условиях на диффузию влияют помимо pH вязкость биологических среды и наличие специфических белков, которые связывают активные вещества и меняют их транспортные свойства. Используемые полупроницаемые мембраны обладают фиксированным размером пор и определённым химическим составом. Они не могут имитировать сложную структуру биологических барьеров, их избирательную проницаемость, наличие ионных каналов, рецепторов и транспортных систем. Это приводит к тому, что скорость высвобождения вещества in vitro может значительно отличаться от реальной биодоступности.

Выводы

Проведённое исследование продемонстрировало эффективность модификации пенополиуретана для создания раневых покрытий с иммобилизованными бактериофагами. Модификация приводит к кардинальному изменению поверхностных свойств материала, превращая гидрофобный пенополиуретан в гидрофильный: время имбибиции капли воды сокращается с 53 мин до 4,3 с, что обеспечивает эффективное впитывание раневого экссудата.

Ключевым результатом работы является установление способности МПУ поддерживать жизнеспособность и литическую активность иммобилизованных бактериофагов. Титрование по методу Аппельмана показало, что модифицированный материал обеспечивает сохранение активности бактериофагов на уровне не ниже 10⁵ БОЕ/мл в течение 8 ч диализа, в то время как для ПУ наблюдалась практически полная потеря активности к этому времени.

Модификация ПУ не только улучшает гидрофильность материала, но и придаёт ему адгезивные, антибактериальные, антиоксидантные и другие свойства, что дополнительно повышает терапевтический потенциал разработанного покрытия за счёт эффективной иммобилизации бактериофагов и их контролируемого высвобождения в раневую среду.

Таким образом, МПУ представляет собой перспективную платформу для создания биомиметических раневых покрытий, способных обеспечивать эффективную доставку бактериофагов в очаг инфекции и поддержание их терапевтической концентрации. Разработанный материал может найти применение в лечении инфицированных ран, особенно при инфекциях, вызванных антибиотикорезистентными штаммами стафилококков.

Перспективными направлениями дальнейших исследований являются изучение кинетики высвобождения фагов в условиях, имитирующих раневую среду, а также проведение доклинических испытаний эффективности разработанного покрытия на экспериментальных моделях инфицированных ран.