Введение

5-фторурацил (5-ФУ) — одно из химиотерапевтических соединений, широко используемое в лечении онкологических заболеваний. 5-ФУ широко используется в практической медицине для лечения ряда солидных опухолей [1]. 5-ФУ быстро метаболизируется в организме, поэтому крайне важно поддержание высокой концентрации в сыворотке крови данного препарата для улучшения его терапевтической активности. Однако использование 5-ФУ в высоких концентрациях связано с высоким риском тяжёлых токсических эффектов [2–4].

В литературе представлены многочисленные исследования, целью которых является создание системы для контролируемого высвобождения 5-ФУ, которые улучшают показатели лечения [5–9].

Полиметакрилаты являются широкодоступным классом синтетических полимеров. Полиметакриловая и полиакриловая кислоты являются водорастворимыми полимерами, имеющими в своём составе функциональные карбоксильные группы, позволяющие проводить их модификацию.

В работе, представленной в 2011 году, предложена универсальная модель рН-чувствительных наночастиц для селективной доставки лекарств, одной из составных частей которых является полиметакриловая кислота (ПМАК) [10]. В 2016 году проведено исследование по изучению противоопухолевых свойств in vitro и in vivo ПМАК, объединённой с золотосодержащими наночастицами, а также с доксорубицином через кислотолабильную цистеиновую связь [11].

Ранее был разработан полимерный комплекс 5-ФУ на основе ПМАК, продемонстрировавший изменение фармакокинетики и профиля биораспределения 5-ФУ после его включения в полимерный комплекс [12].

Валидация аналитических методик для определения лекарственных средств (ЛС) в составе полимерных частиц (мицеллы, полимеросомы), комплексов приобретает особую значимость в современной фармацевтике, однако методологические аспекты валидации для подобных систем освещены в научной литературе фрагментарно [13, 14]. Полимерные комплексы активно разрабатываются для улучшения биодоступности, стабильности и контролируемого высвобождения ЛС, особенно в онкологии, терапии нейродегенеративных заболеваний. Однако интеграция ЛС в полимерную матрицу приводит к сложностям в анализе: матричные эффекты, низкие концентрации активного вещества (часто <1 мкг/мл), неоднородность распределения ЛС требуют строгой валидации методик для обеспечения точности, воспроизводимости и селективности.

Целью данного исследования является разработка и валидация методики количественного определения 5-ФУ с помощью ультрафиолетовой спектроскопии (УФ-спектроскопия) в полимерном комплексе на основе ПМАК.

Материалы и методы

Объектом исследования являлись образцы экспериментального полимерного комплекса 5-ФУ, представляющие собой лиофилизат для приготовления раствора.

Полимерный комплекс 5-ФУ на основе ПМАК был получен методом жидкофазного синтеза по ранее описанной методике [15].

В качестве метода определения количественного содержания 5-ФУ в составе полимерного комплекса использовали метод УФ-спектроскопии.

Определение проводилось в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0003 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» ГФ XV издания [16].

Поскольку полимерное производное 5-ФУ представляет собой 5-ФУ, связанный водородными связями с карбоксильными группами ПМАК, то для анализа готовили растворы исходных веществ.

Приготовление испытуемых растворов

0,00083% раствор 5-ФУ. Точную навеску субстанции 5-ФУ (~0,01 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде, после доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали. Отбирали аликвоту 8,3 мл, помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объём колбы растворителем до метки, перемешивали.

0,01% раствор ПМАК. Точную навеску ПМАК (~0,01 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде, после доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали.

0,01% раствор полимерного комплекса 5-ФУ. Точную навеску полимерного комплекса 5-ФУ (~0,01 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде, после доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали.

Ультрафиолетовые спектры поглощения получали с помощью спектрофотометра UV–1800 (Япония, Shimadzu) в пределе длин волн 190-400 нм (дата последней поверки — 29.09.2025). У полученных растворов измеряли оптическую плотность при длине волны 265 нм (для определения 5-ФУ) в кювете толщиной 1 см.

Линейная зависимость между поглощением и концентрацией образца позволяет проводить количественное определение. Поэтому содержание 5-ФУ рассчитывалось также спектрофотометрически, основываясь на законе Бугера-Ламберта-Бэра. Калибровочная кривая определялась путём измерения поглощения нескольких стандартных растворов известной концентрации.

Приготовление стандартных растворов 5-ФУ для оценки показателя «Линейность»

0,01% стандартный раствор 5-ФУ в водной среде. Точную навеску субстанции 5-ФУ (~0,01 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде, доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали.

0,01% стандартный раствор 5-ФУ в среде фосфатного буферного раствора (pH 7,4). Точную навеску субстанции 5-ФУ (~0,01 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в фосфатном буфере, доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали.

0,01% стандартный раствор 5-ФУ в среде цитратного буферного раствора (pH 5,1). Точную навеску субстанции 5-ФУ (~0,01 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в фосфатно-цитратном буфере, доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали.

Из каждого из вышеперечисленных стандартных растворов отбирали аликвоту 5 мл и разводили её в 2 раза. Затем последовательно отбирали по 5 мл из полученных растворов и также разводили в два раза. Всего процедура повторяется 5 раз. Для получения промежуточных концентраций из второго, третьего, четвёртого и пятого разведения отбирались аликвоты объёмом 3 мл и смешивались с 1,5 мл соответствующего растворителя.

Приготовление испытуемых растворов для оценки показателя «Правильность»

0,008% раствор полимерного комплекса 5-ФУ. Точную навеску полимерного комплекса 5-ФУ (~0,01 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде, доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали. Отбирали аликвоту 80 мл, помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объём колбы растворителем до метки, перемешивали.

0,01% раствор полимерного комплекса 5-ФУ. Точную навеску полимерного комплекса 5-ФУ (~0,01 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде, доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали.

0,012% раствор полимерного комплекса 5-ФУ. Точную навеску полимерного комплекса 5-ФУ (~0,012 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде, доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали.

Каждый из растворов готовился трижды в соответствующем растворителе (вода, фосфатный буферный раствор (pH 7,4), цитратный буферный раствор (pH 5,1).

Приготовление испытуемых растворов для оценки показателя «Повторяемость»

Точную навеску полимерного комплекса 5-ФУ (~0,01 г) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в растворителе, доводили объём колбы тем же растворителем до метки и перемешивали.

Процедуру повторяли 6 раз.

Приготовление испытуемых растворов для оценки показателя «Прецизионность»

Испытуемые растворы для оценки показателя «Прецизионность» готовили в соответствии с методикой, использованной при определении правильности. Процедуру выполняли независимо два исследователя для трёх концентраций 5-ФУ: 0,0056, 0,0070 и 0,0084 мг/мл. Для каждой концентрации каждый исследователь приготовил по шесть параллельных проб. 

Оптическая плотность приготовленных стандартных растворов 5-ФУ, а также испытуемых растворов полимерного комплекса 5-ФУ для определения валидационных показателей (правильность, повторяемость, прецизионность) в разных средах измерялась при длинах волн от 265-267 нм (n=5), в зависимости от pH среды и от использованного буферного раствора.

Содержание 5-ФУ вычисляли по уравнениям калибровочных кривых (формула (1):

Х =  A/B, где                                              (1)

Х — содержание 5-ФУ, мг/мл;

А — оптическая плотность, усл.ед.;

b — коэффициент линейной регрессии соответствующей калибровочной кривой.

Предложенная методика количественного определения 5-ФУ в полимерном производном валидирована в соответствии с ОФС «Валидация аналитических методик» (ГФ XV ОФС.1.1.0012) по показателям специфичности, линейности, правильности, прецизионности (повторяемость (сходимость), промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность).

Результаты и их обсуждение

В результате межмолекулярного взаимодействия 5-ФУ и карбоксильными группами остатков ПМАК образуется водорастворимый полимерный комплекс (рис. 1).

Рис. 1. Межмолекулярное взаимодействие 5-ФУ с карбоксильными группами ПМАК

Примечание: R — остаток ПМАК

Межмолекулярное взаимодействие обусловлено образованием водородных связей между электроотрицательным атомом фтора в 5-ФУ и атомом водорода в карбоксильном остатке МАК, имеющем частично положительный заряд и связанным ковалентной связью с электроотрицательным атомом кислорода. Также водородная связь образуется между атомом водорода в группе –NH-пиримидинового кольца и атомом кислорода в остатке МАК, а также между атомом кислорода и атомом водорода в остатке МАК. Такой механизм свидетельствует о полной комплементарности 5-ФУ остатку МАК. Каждая молекула 5-ФУ связывает полностью два остатка МАК и частично третий остаток.

Данные УФ-спектроскопии (рис. 2) являются методом, подтверждающим образование межмолекулярного комплекса 5-ФУ с полимером ПМАК.

Рис. 2. УФ-спектры полимерного комплекса 5-ФУ (0,1 мг/мл), ПМАК (0,1 мг/мл), 5-ФУ (0,0083 мг/мл)

Примечания: 1 — раствор полимерного комплекса 5-ФУ; 2 — раствор ПМАК; 3 — раствор, содержащий субстанцию 5-ФУ.

Для оценки возможности использования полимерного комплекса 5-ФУ в качестве системы доставки был проведен анализ высвобождения 5-ФУ в средах, имитирующих биосреды организма.

Особенностью интерполимерных комплексов, конъюгатов противоопухолевых ЛС является их устойчивость в среде, имитирующей среду кровяного русла (pH 7,35–7,45) и распадаемость комплекса, конъюгата с высвобождением противоопухолевого ЛС в среде, имитирующей внутриклеточное пространство (pH 6,8–7,2), в среде, имитирующей опухолевое окружение (pH 6,2–6,8) или в среде, имитирующей pH внутриклеточных лизосом (pH 4,0–5,0).

В качестве сред, имитирующих биосреды использовались 2 буферных раствора: ФБ с рН 7,4 — для имитации кровяного русла и ЦБ с рН 5,1 — для имитации внутриклеточного пространства.

Получено, что высвобождение полимерного комплекса с 5-ФУ в кислой среде (при pH 5,1) выше на 15,92%, чем при pH 7,4. Данное обстоятельство объясняется  ускоренным гидролизом pH-чувствительных связей в полимерной матрице при пониженном значении pH; изменением электростатических взаимодействий между носителем и 5-ФУ; увеличением степени набухания полимера в кислых условиях, что облегчает диффузию 5-ФУ.

Полученные данные имеют важное практическое значение для разработки систем направленной доставки противоопухолевых ЛС.

Поэтому в ходе исследования проводилась валидация методики количественного определения 5-ФУ методом УФ-спектроскопии в разных средах: в воде; в фосфатном буферном растворе (pH 7,4); в цитратном буферном растворе (pH 5,1).

Оценка показателя «Специфичность». Специфичность метода определялась путём сравнения УФ-спектров поглощения исследуемых образцов и возможных мешающих компонентов в используемых растворителях.

Первоначально были записаны УФ-спектры всех применяемых в методике растворителей (вода очищенная, фосфатный (pH 7,4) и цитратный (pH 5,1) буферы) в диапазоне 190–400 нм (рис. 3).

Рис. 3. УФ-спектры используемых растворителей

Установлено, что ни один из растворителей не поглощает свет в области 260–265 нм, то есть их собственный вклад в сигнал отсутствует.

УФ-спектры растворов стандартного образца 5-ФУ во всех используемых средах показали четкий максимум поглощения при 265-267 нм (рис. 4). Это подтвердило, что данная полоса поглощения является характерной для 5-ФУ и может использоваться как аналитический сигнал.

Рис. 4. УФ-спектры растворов 5-ФУ (0,0083 мг/мл)

Для подтверждения того, что полоса поглощения при 265-267 нм в растворе исследуемого полимерного комплекса 5-ФУ принадлежит именно молекуле лекарственного вещества, а не полимеру или примесям, были записаны его УФ-спектры (рис. 5).

Рис. 5. УФ-спектры растворов полимерного комплекса 5-ФУ (0,1 мг/мл)

Спектры поглощения полимерного комплекса 5-ФУ совпали со спектрами чистого 5-ФУ, демонстрируя такой же максимум при 265-267 нм в зависимости от среды. Совпадение спектров доказывает, что предложенный спектрофотометрический метод является специфичным для определения 5-ФУ в составе полимерного комплекса. Полимерный носитель не мешает измерению концентрации 5-ФУ в выбранном диапазоне длин волны.

Оценка показателя «Линейность». Линейность метода оценивали в рабочем диапазоне концентраций 5-ФУ от 0,0016 до 0,0167 мг/мл.

Перед статистической обработкой данных для построения калибровочной зависимости была проведена проверка однородности измерений для каждой приготовленной концентрации стандартных растворов. Для выявления грубых ошибок в малых выборках использовали Q-критерий. При доверительной вероятности p=0,99 все вычисленные значения Q-критерия для экспериментальных данных не превысили критического табличного значения Qкрит. (0,99; n=0,760). Это подтвердило однородность выборки и отсутствие статистических выбросов, что позволило перейти к дальнейшему анализу.

Зависимость оптической плотности от концентрации 5-ФУ в указанном диапазоне хорошо описывается линейным уравнением, которое имеет вид y = bx + a (рис. 6).

Рис. 6. Калибровочные графики для исследования линейности метода при количественном определении 5-ФУ методом УФ-спектроскопии

Проверка значимости коэффициентов была проведена по критерию Стьюдента (табл. 1).

Установлено, что коэффициенты a и b являются статистически значимыми для среды воды и фосфатного буферного раствора (pH 7,4). Итоговое уравнение прямой для воды — y=56,01x+0,0162; для фосфатного буферного раствора (pH 7,4) — y=50,365x+0,029. Для среды цитратного буферного раствора (pH 5,1) установлено, что коэффициент b является статистически значимым, в то время как коэффициент a статистически значимым не является. На основании этого калибровочная зависимость была перестроена в виде уравнения y=bx, проходящего через начало координат. Итоговое уравнение прямой для цитратного буферного раствора — y=51,645x. Коэффициент детерминации R2 равен 0,9994.

При изучении линейной зависимости была проведена статистическая обработка экспериментальных данных (табл. 2).

Оценка показателя «Правильность». Правильность аналитической методики оценивалась для 9 определений 3-х концентраций (0,0056 мг/мл; 0,0070 мг/мл; 0,0084 мг/мл). Среднее значение открываемости 5-ФУ по результатам количественного определения вещества в среде воды составило 98,91%, в среде фосфатного буферного раствора (pH 7,4) составило 99,23%, а для методики в среде цитратного буферного раствора (pH 5,1) — 98,48% (табл. 3).

Оценка показателя «Аналитическая область». Диапазон применения (аналитическая область) аналитической методики оценивали по результатам оценки показателей «Линейность» и «Правильность». Критерий приемлемости: для количественного определения основного вещества диапазон применения методики должен составлять 80-120% от номинального содержания.

На основании результатов, полученных при оценке показателей «Линейность» и «Правильность», диапазон применения методики составляет 80–120%, поскольку показатель «Правильность» определяли при концентрациях 80% (0,0800 мг/мл полимерного комплекса 5-ФУ и 0,0056 мг/мл по 5-ФУ), 100% (0,1000 мг/мл полимерного комплекса 5-ФУ и 0,007 мг/мл по 5-ФУ) и 120% (0,1200 мг/мл полимерного комплекса 5-ФУ и 0,0084 мг/мл по 5-ФУ) от номинального содержания. Показатель «Линейность» определяли в диапазоне 22,33-238,57% от концентрации стандартного образца, используемой в аналитической методике.

Заключение: валидируемый показатель соответствует критерию приемлемости.

Оценка показателя «Прецизионность».   Прецизионность исследовалась на однородных образцах и оценивалась в двух вариантах: повторяемость (сходимость) и внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность.

Повторяемость (сходимость).

Показатель повторяемости оценивали по результатам шести параллельных определений концентрации с известным содержанием 5-ФУ (табл. 4). Все измерения были выполнены одним исследователем на одном приборе в течение короткого промежутка времени.

Полученное значение RSD не превысило 2%, что подтверждает, что предложенный метод обладает удовлетворительной повторяемостью (сходимостью) и обеспечивает получение воспроизводимых результатов при многократном анализе проб в идентичных условиях.

Внутрилабораторная прецизионность.

Оценка внутрилабораторной прецизионности проводилась для оценки воспроизводимости результатов метода в условиях, допускающих некоторые варьируемые факторы внутри одной лаборатории. Исследование было выполнено на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России в течение короткого промежутка времени при использовании одного и того же аналитического оборудования.

Ключевым варьируемым фактором в данном исследовании выступил исполнитель (оператор). Анализ проводили два разных исследователя, каждый из которых выполнил серию определений для трёх различных концентраций стандартного раствора 5-фторурацила: 0,0056 мг/мл; 0,0070 мг/мл; 0,0084 мг/мл.

Для каждой концентрации и каждого оператора были рассчитаны основные статистические показатели (табл. 5).

Воспроизводимость оценивалась по критерию Стьюдента. Поскольку tрасч<T (99%, 5), то результаты двух выборок следует считать свободными от систематической ошибки, а значит, воспроизводимыми.

Выводы

Доказано, что разработанная методика удовлетворяет требованиям валидности по показателям специфичности, линейности, правильности, прецизионности (повторяемость (сходимость), промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность) в соответствии с ОФС «Валидация аналитических методик» (ГФ XV ОФС.1.1.0012).